2014 Fiscal Year Annual Research Report
神経幹細胞の発生段階依存的な分化能変換の分子機構解明
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26710003
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
堅田 明子 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00615685)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 幹細胞 / ニッチ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、胎仔からの神経幹細胞の単離・培養系、またES細胞やiPS細胞を用いた神経幹細胞の分化誘導法が確立し、脳を形成する個々の細胞の分化機構が飛躍的に解明された。しかし、現在の分化誘導法においても、胎生後期に出現する浅層ニューロンの産生効率は著しく低く、神経幹細胞が深層ニューロンから浅層ニューロンへと分化能を変化させるスイッチング機構には未だ不明な点が多い。我々は、神経幹細胞が発生の進行に伴い、産生する細胞種を変換していく機構に関して、生体における幹細胞の微小環境に着目をして、解析を進めてきた。これまでに、神経幹細胞の低酸素濃度での培養と分化、また骨形性因子BMP2が浅層ニューロンに特異的に発現するCux1/2遺伝子の発現誘導を引き起こすことを明らかにしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
胎生中期のマウス終脳より単離した神経幹細胞にBMP2を添加したところ、刺激3時間後には浅層ニューロンマーカーであるCux1/2の遺伝子発現が2-3倍上昇した。そこで、BMPシグナルの下流で機能する転写因子Smad1に着目、これが直接Cux1/2遺伝子の発現を誘導可能か確かめるため、抗リン酸化-Smad1抗体を用いて、クロマチン免疫沈降実験を行った。その結果、リン酸化Smad1がCux1/2遺伝子のプロモーターに結合することを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はまず、リン酸化Smad1の結合領域をさらに詳細に解析するため、ChIP-seq解析を予定している。活性型Smad1がリクルートされるゲノム領域を網羅的に解析することで、BMPのニューロン分化における新規の標的遺伝子を探索する。
また、子宮内電気穿孔法を用いて、Smad1の発現減弱、もしくは不活性型Smad1（Dominant negative-Smad1）の強制発現を胎生13.5日齢のマウスの神経幹細胞で誘導し、これらの細胞が産生するニューロンサブタイプを免疫組織化学染色により解析する。
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| Causes of Carryover |
本年度の成果により、Cux1/2遺伝子プロモーターにおけるSmad1結合領域の一つが明らかとなったが、他にも存在することが考えられる。これらの解析にはChIP-seqによる網羅的な解析が有効であると考える。そこで、本年度に予定していた他の実験を翌年度以降に順延、研究費の一部を次年度に繰り越すことで、ChIP-seq解析を可能にした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
抗リン酸化-Smad1抗体を用いたChIP-seq解析を予定する。そのため、抗体やライブラリー作製キット等の研究試薬購入に使用する。
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