テロメラーゼ非依存的テロメア維持機構を標的としたがん治療法の確立

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26710006
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 定家 真人 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (70415173)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 遺伝子 / 癌 / ゲノム / トランスレーショナルリサーチ / 老化

Outline of Annual Research Achievements

がん細胞の増殖には、染色体末端を保護するテロメアの維持が不可欠である。本研究では、テロメア維持機構の中でも、テロメラーゼに依存しないテロメア維持機構（ALT機構と呼ばれる）を標的としたがん治療法の開発を行う。このテロメア維持機構は、全臨床がん症例の10%、特に肉腫の50%にのぼる症例で活性化されているものの、これまで治療標的として注目されてこなかった。本研究は、肉腫を中心とした、治療薬の開発が遅れている難治性がんの治療法の確立に貢献する。具体的な研究目的は以下の通りである。
1.テロメラーゼ非依存的なテロメア維持に必要な新規分子の同定
2.新規・既知のALT関連分子阻害法の開発と、ALT依存性がん細胞の選択的増殖抑制機構の解明
1については、研究代表者が所属する研究室で保有している複数のALT細胞株とテロメラーゼ陽性細胞株について、細胞抽出液からクロマチンを含む画分を得て、ALT細胞にのみ共通して見出されるタンパク質を質量分析機で解析した結果、フィラミンAとアクチンが同定された。
2については、1で同定されたフィラミンAに対するノックダウン用のshRNA発現ベクターを作成した。また、既にALT細胞の増殖に重要であることが知られているタンパク質のノックダウン用shRNA発現ベクターも作成した。これらのベクターを、テロメラーゼ陽性細胞とALT細胞に導入して、それぞれの細胞に増殖の違いがあるかどうかを検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究代表者が所属する研究室で保有している複数のALT細胞株とテロメラーゼ陽性細胞株について、細胞抽出液からクロマチンを含む画分を得て、ALT細胞にのみ共通して見出されるタンパク質を質量分析機で解析した結果、フィラミンAとアクチンが同定された。同定されたタンパク質のうち、フィラミンAに対するノックダウン用のshRNA発現ベクターをまず作成した。また、既にALT細胞の増殖に重要であることが知られているタンパク質のノックダウン用shRNA発現ベクターも作成した。これらのベクターを、テロメラーゼ陽性細胞とALT細胞に導入して、それぞれの細胞に増殖の違いがあるかどうかを検討したところ、フィラミンAのノックダウンに関しては、ALT細胞への特異性は認められず、テロメラーゼ陽性細胞株でも増殖の抑制が認められた。既知因子であるMUS81のノックダウンは、HOSテロメラーゼ陽性細胞に比べて、SaOS-2 ALT細胞の増殖阻害率の低下の方が大きかった。

Strategy for Future Research Activity

細胞抽出液のクロマチン画分から得られた、ALT細胞特異的なタンパク質は、主に細胞質に局在し、複数の細胞機能を持つタンパク質であると考えらえる。そのため、ノックダウンした場合にテロメラーゼ陽性細胞、ALT細胞問わず増殖が抑制されたと考えられる。今後はタンパク質の核内機能のみを抑制するような変異体を作成し、注目する機能の範囲を絞った解析が必要であると考えられる。
クロマチンからALT細胞特異的な因子の同定を試みる以外に、遺伝学的手法を用いたALT特異的因子の単離も試みる。CRISPR-Cas9システムを用いた、遺伝子変異導入ガイドRNAライブラリーを用いて、ALT細胞の増殖を阻害だけを阻害するガイドRNAをスクリーニングにより取得する。スクリーニングにより標的遺伝子が見つかった場合は、その遺伝子への変異導入、あるいは阻害剤により遺伝子機能の阻害を試みる。効果的に機能を阻害できる方法が見つかったら、ALT細胞でこの阻害を実行し、細胞増殖の抑制（細胞死や細胞老化の誘導）が起こるかを調べる。本研究では、標的タンパク質の機能阻害から、細胞増殖停止までに必要とされる期間に着目して、この期間ができるだけ短くなるような標的遺伝子を探す。
ALT細胞に特徴的な核内構造体APBの構成要素であるPMLや、テロメア結合因子TRF1、APBに局在するタンパク質に付加されるSUMOの免疫沈降を行い、それぞれのタンパク質と相互作用するタンパク質を質量分析により同定する。得られたタンパク質のリストをALT細胞とテロメラーゼ陽性細胞の間で比較し、ALT細胞でのみ検出されるAPB相互作用分子を得る。上記の方法で、クロマチンタンパク質や、APBタンパク質が得られたら、これらが染色体にどのように分布するかをChIP-Seq法で調べる。

Causes of Carryover

次年度に、次世代シーケンサーによる解析を共同研究により計画しており、これにかかる物品費が他のものと比べ大きいため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次世代シーケンサーによる解析を共同研究により行う予定。