テロメラーゼ非依存的テロメア維持機構を標的としたがん治療法の確立

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26710006
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 定家 真人 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (70415173)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 遺伝子 / 癌 / ゲノム / トランスレーショナルリサーチ / 老化

Outline of Annual Research Achievements

がん細胞の増殖には、染色体末端を保護するテロメアの維持が不可欠である。本研究では、テロメア維持機構の中でも、テロメラーゼに依存しないテロメア維持機構（ALT機構と呼ばれる）を標的としたがん治療法の開発を行う。このテロメア維持機構は、全臨床がん症例の10%、特に肉腫の50%にのぼる症例で活性化されているものの、これまで治療標的として注目されてこなかった。本研究は、肉腫を中心とした、治療薬の開発が遅れている難治性がんの治療法の確立に貢献する。具体的な研究目的は以下の通りである。
1.テロメラーゼ非依存的なテロメア維持に必要な新規分子の同定
2.新規・既知のALT関連分子阻害法の開発と、ALT依存性がん細胞の選択的増殖抑制機構の解明
本年度の研究では、CRISPR-Cas9システムを利用した網羅的なガイドRNA（gRNA）スクリーニングを行い、ALT細胞の増殖に特異的に必要とされる遺伝子の同定を試みた。gRNAを発現させるベクターのライブラリーを、ALT細胞株またはテロメラーゼ陽性細胞株に導入し、導入直後の細胞と導入後一定期間培養した細胞を用意した。それぞれの細胞からゲノムDNAを回収し、まずは、全gRNAベクターに対する、増殖に必要とされる既知の遺伝子（ここではRPS19）をターゲットとするgRNAベクターの存在比を定量的PCRで調べた。その結果、RPS19 gRNAベクターは、導入直後に比べて一定期間培養したのちに減少することが確認されたため、得られたゲノムDNAサンプルは、次世代シーケンサーによる網羅的な解析に適するものであることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ALT細胞株とテロメラーゼ陽性細胞株に、Cas9ヌクレアーゼとgRNAを発現させるベクターを導入し、ベクターをゲノム上に保有する細胞のみ選択したのち、1日後の細胞（PS1）と、12日後の細胞（PS12）を回収した。gRNAは、2万種類弱の遺伝子に対してそれぞれ3種類ずつ設計されたもののほか、miRNAに対するもの、ヒトゲノムにない配列に対するものを含む約6万5千種類が混合されたライブラリーである。PS1と比較してPS12細胞での全gRNAベクターに対するあるgRNAベクターの存在比が減少していれば、そのgRNAのターゲット遺伝子は細胞増殖に必要であると考えられる。
回収した細胞からゲノムDNAを調製し、gRNAをコードする部分の近傍を一度PCRで増幅させた。このPCR産物を鋳型として、まずは、ヒト細胞の増殖に必要であることが知られているRPS19に対するgRNAに固有のプライマーを用いて、このgRNAベクターの存在量を定量的PCRで解析した。その結果、ALT細胞株とテロメラーゼ陽性細胞株の両方において、PS1に比べてPS12でのRPS19 gRNAベクターの存在比が減少していた。この結果は、本研究で行ったCRISPR-Cas9システムを利用した遺伝学的スクリーニングが順調に進んでいることを示唆する。

Strategy for Future Research Activity

本年度行ったスクリーニングにより得られたgRNAベクターを次世代シーケンサーに供し、ALT細胞株では減少し、テロメラーゼ陽性細胞株では減少しないものを見出す。スクリーニングにより標的遺伝子が見つかった場合は、その遺伝子への変異導入、あるいは阻害剤により遺伝子機能の阻害を試みる。効果的に機能を阻害できる方法が見つかったら、ALT細胞でこの阻害を実行し、細胞増殖の抑制（細胞死や細胞老化の誘導）が起こるかを調べる。本研究では、標的タンパク質の機能阻害から、細胞増殖停止までに必要とされる期間に着目して、この期間ができるだけ短くなるような標的遺伝子を探す。
ALT細胞に特徴的な核内構造体APBの構成要素であるPMLや、テロメア結合因子TRF1、APBに局在するタンパク質に付加されるSUMOの免疫沈降を行い、それぞれのタンパク質と相互作用するタンパク質を質量分析により同定する。得られたタンパク質のリストをALT細胞とテロメラーゼ陽性細胞の間で比較し、ALT細胞でのみ検出されるAPB相互作用分子を得る。上記の方法で、クロマチンタンパク質や、APBタンパク質が得られたら、これらが染色体にどのように分布するかをChIP-Seq法で調べる。

Causes of Carryover

次年度に、次世代シーケンサーによる解析を共同研究により計画しており、これにかかる物品費が他のものに比べ大きいため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次世代シーケンサーによる解析を共同研究により行う。