全ゲノム操作が拓く難培養細菌の遺伝子工学

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26710015
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 柿澤 茂行 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (10588669)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ゲノム / 遺伝子 / 微生物

Outline of Annual Research Achievements

難培養性細菌（難培養細菌・未培養細菌）と呼ばれる細菌は、培養が不可能もしくは非常に困難な細菌である。難培養性細菌は決して珍しいものではなく、近年のメタゲノム解析などの台頭により、環境中の微生物の99%以上は培養できないことが明らかとなり、これにより新たな微生物像が浮き彫りとなった。これらの難培養性細菌は、その全ゲノム配列を決めることで多くの知見が得られる一方で、遺伝子のノックアウトや過剰発現ができないという技術的な欠陥のため、その遺伝子の機能についての確実な証明はほとんどされていないのが現状である。
本研究は、近年開発された「全ゲノム操作技術」を応用することで、難培養細菌の培養および遺伝子操作系の開発を目指し、難培養細菌の持つ多様な機能を解明することを目的とする。これには、全ゲノム操作、全ゲノムクローニング、全ゲノム移植などが可能でかつ培養可能な細菌であるマイコプラズマ(Mycoplasma capricolum)を用いる。
本年度は難培養性細菌の全ゲノムをクローニングした。用いたベクターは、YAC（酵母人工染色体）ベクターに、マイコプラズマ用の耐性マーカーを加え、かつ、マイコプラズマ細胞内での複製に必須なOriC領域を保持したものと、OriC領域を持たないものの2種類を作成した。これは、OriC領域に存在すると思われる酵母の複製開始点によって、ベクターのみのクローンが多数得られてしまうという障壁があったため2種類作成した。次にクローニングした難培養性細菌の全ゲノムを培養可能なマイコプラズマ (M. capricolum) ゲノムへと導入するための手法の改良を試みた。酵母の細胞融合とその後の相同組換えによって融合ゲノムを作成する手法を検討し、これにより研究が進展するであろう端緒をつかんだ。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

全ゲノムをクローニングする系を確立するため、ベクターを新たに開発し、これをテストすることができた。また、マイコプラズマでの複製に必要なOriC領域の導入には、タイミングが重要であることが分かった。加えて、酵母の細胞融合とその後の相同組換えによって融合ゲノムを作成する手法を確立した。

Strategy for Future Research Activity

今後も引き続き研究を推進し、ゲノムクローニング系の確立を行う。酵母の細胞融合とその後の相同組換えによって融合ゲノムを作成し、それをマイコプラズマ細胞へのゲノム移植を行う。

Causes of Carryover

酵母の細胞融合とその後の相同組換えによって融合ゲノムを作成する手法について新たな情報が得られ、一部追加で調査すべき必要性が生じたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

酵母の細胞融合と相同組換えに関わる研究に要する消耗品費として使用する予定。