2017 Fiscal Year Annual Research Report
根の緑化応答から明らかにする葉緑体の発達メカニズムとその制御
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26711016
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小林 康一 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (40587945)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / 光合成 / 転写因子 / サイトカイニン / クロロフィル / 緑化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
一般に植物の根は炭素源を葉で行われる光合成に依存するため、根では葉緑体の発達は抑制され、通常ほとんど緑化しない。一方で、自然界では食害や生育環境の激変などにより光合成器官の喪失が常に起こり得るため、植物はソース器官喪失に応答し新たな光合成器官の構築を行う仕組みを持つ。本研究の目的は、葉緑体分化の制御機構と光合成活性化の仕組みを解き明かし、葉緑体の分化・発達制御モデルを分子レベルで構築することにある。
報告者の先行研究により、地上部を切除したシロイヌナズナの根の緑化にはサイトカイニンシグナルが必須であること、さらにその下流ではGLK, GNC, GNLといった転写因子が働くことが明らかとなっていた。とくに、GNCやGNL過剰発現体の根では核にコードされた光合成関連遺伝子だけでなく、葉緑体コードの遺伝子の発現も強く誘導されたことから、これらの因子の重要性が強く示唆された。そこで、GNLの遺伝子発現をエストラジオール処理により任意のタイミングで誘導できる形質転換体を作成し、根の緑化プロセスを詳細に解析したところ、PORCというクロロフィル合成に関わる酵素遺伝子の発現がGNLの誘導とともに発現が直ちに上昇すること、その他の主要なクロロフィル合成系の遺伝子発現はもっと遅れて誘導されてくることが明らかとなった。さらに、葉緑体にコードされた光合成に関連する遺伝子もGNLの誘導後数日かけて徐々に発現が上昇することが分かった。また、葉緑体での転写に関わる核コード因子も葉緑体コード遺伝子と同様のタイミングで誘導されたため、核の転写関連因子が速やかに発現することで葉緑体コードの遺伝子発現が起こるわけでは無いことが明らかとなった。葉緑体コードの光合成遺伝子の発現とともに根の光合成量子収率が徐々に上昇したことから、葉緑体の転写を活性化する仕組みが緑化制御に重要であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
報告者は今年度までの研究から、GNLのエストラジオール誘導系を確立し、得られた形質転換体においてエストラジオール依存的な発現の誘導を複数のラインで確認することに成功した。さらに、それらのラインを用いて、エストラジオールによるGNLの誘導後のクロロフィル合成関連遺伝子や光合成関連遺伝子の発現プロファイルを明らかにすることができた。そこで、さらに大規模なトランスクリプトーム解析を行うことで詳細な解析を行うため、さらに次の世代におけるエストラジオールへの応答性を確かめたところ、多くの有力なラインでGNL誘導系に強いサイレンシングが起こってしまっていたことが分かった。サイレンシングの原因が不明であり、また一般的にその理由を明らかにするのは困難であるため、原因の究明は今後の課題とし、本研究課題では、形質転換体の再スクリーニングによりサイレンシングがみられないラインを得ることを最優先とした。形質転換体候補のストックを再度スクリーニングしGNLのエストラジオール誘導性を再評価した結果、有効な株を選出することに成功した。そこで、いくつかの光合成関連遺伝子やクロロフィル合成関連遺伝子の発現誘導を調べたところ、確かにそれらの遺伝子が誘導され、最終的にはGNLの恒常的な過剰発現体と似たような表現型を示すことを確かめた。今年度は原因不明のサイレンシングにより計画に遅れが生じたため、補助期間を延長し、再度得られた株で葉緑体分化のプロセスを、光合成活性、クロロフィル蓄積と遺伝子発現プロファイルの観点から明らかにする方針とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
形質転換体ストックの再スクリーニングにより、サイレンシングの影響を受けていないラインを得ることができたので、延長期間である次年度は、そのラインを用いてGNLの誘導から葉緑体分化に至るプロセスを詳細に解析する予定である。とくに、GNLの誘導から急速に発現が上昇する光合成関連遺伝子は少数であり、大半の遺伝子は徐々に発現が上昇したことから、多段階のプロセスを経て光合成関連遺伝子の発現誘導が起こることが示唆されている。葉緑体分化時にはさまざまな過程がそれぞれさまざまに影響し合うことから、その複雑な相互作用を解き明かすことを目的に、具体的な方策としては、葉緑体分化に関わる遺伝子の発現が起こるタイミングの直前や直後に光合成活性やクロロフィル合成、チラコイド膜脂質合成を阻害剤により阻害し、それが相互にどのような影響お与えるのかを、イメージングPAMによる光合成活性測定や色素、脂質の定量的解析などで明らかにする。さらに、それらの葉緑体内で起こるプロセスを解析すると同時に遺伝子発現プロファイルをリアルタイムPCR解析により明らかにすることで、これらのプロセスが相互にどのように関連し合っているのかを調べる。
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| Causes of Carryover |
当初の予定では、転写因子GNLの誘導により根で起こる葉緑体分化過程を詳細に解析する予定であったが、得られた形質転換体の評価を行ったところ、導入GNL遺伝子に原因不明のサイレンシングが起きていることが分かった。そこで、サイレンシングの無い形質転換体の再スクリーニングとその厳密な評価を行ったことにより、計画に大幅な遅延が生じ、予定していたトランスクリプトーム解析が今年度内に行えない事態となった。これまでに得られていた形質転換体候補のストックを再度スクリーニングしGNLのエストラジオール誘導性を再評価した結果、有効な株を選出することに成功したため、次年度では、再度得られた株の根を用いて、GNL誘導後の光合成活性、クロロフィル蓄積と遺伝子発現プロファイルを解析し葉緑体分化のプロセスの詳細を明らかにする予定である。当初の予定のトランスクリプトーム解析も解析の予定に入れているが、つい最近シロイヌナズナの芽生えを用いた研究によって緑化過程のGNL類似遺伝子（GNC）のターゲット因子の大規模トランスクリプトーム解析結果が海外にグループにより報告されたことから（Bastakis et al. 2018）、その結果も精査したうえでどのような遺伝子の解析に焦点を当てるのかを分析し、研究をデザインしていく。
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