2016 Fiscal Year Annual Research Report
The analysis for the regulation of chromosome segregation during meiosis I
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26711020
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
作野 剛士 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 准教授 (10504566)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 減数分裂 / MEIKIN / コヒーシン / シュゴシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
減数第一分裂期では、姉妹染色分体ペアは同じ極からのびたスピンドルによって捉えられる“一方向性結合”が確立される。その結果、減数第一分裂期では相同染色体ペアが互いに両極へと”還元”分配される。この時、姉妹染色分体を接着させていたコヒーシン複合体は分解を受けるが、セントロメア周辺だけは分解から保護される。この分解保護に働くのがシュゴシンであり、シュゴシンはBub1によってリン酸化されたヒストンH2Aによってセントロメアへリクルートされる。我々の分裂酵母をモデルとしたこれまでの解析から、一方向性結合を確立するためには、減数分裂期特異的な動原体因子、Moa1によって動原体へと局在化したPolo様キナーゼ(Plo1)の活性が必要であることが示されていた。また、Moa1の破壊株では、一方向性結合だけでなく、セントロメアコヒーシンの分解保護機能も欠損していることも明らかになっていた。これらの表現型は、Moa1のマウスホモログであるMEIKINのKOマウスや、Polo様キナーゼ(Plk1)の活性阻害によっても、生殖細胞において同様な表現型が観察されていた。そこで、Moa1やMEIKINがセントロメアコヒーシンの分解保護を果たす分子機構の解明を試みた結果、Moa1によって局在化したPlo1は、Mph1と同様なSpc7サイトをリン酸化し、Mph1と同様にSpc7とBub1との結合を促進することが明らかになった。また、moa1 mph1の二重破壊株ではBub1およびシュゴシンのセントロメア局在やコヒーシンの保護機能が消失した。また、このPlk1とMph1による協調的なシュゴシンの制御機構はマウス生殖細胞でも保存されていることも明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々ヒトを含め有性生殖を採用したほとんどの生物にとって、半数体の配偶子を形成する減数分裂過程は、遺伝情報の本体である染色体を次世代へと継承する上で必須であり、高度に保存されたプロセスである。その減数分裂過程では、一方向性結合を介した相同染色体の分配(還元分配)と、セントロメアコヒーシンの分解保護、これら２つの仕組みが体細胞分裂とは根本的に異なり、生物はこの仕組みを獲得することで姉妹染色分体の分配に先立って相同染色体を分配させることが可能となった。その結果、最終的にゲノムを半減させて配偶子に伝播する機構を得るに至り、そしてこの秀逸な仕組みを進化的に受け継いできた。
今回の解析では、減数分裂を減数分裂たらしめる２つの仕組みのうち、セントロメアコヒーシンの分解保護の理解が進んだ。特に、これまで減数分裂期に動原体へと局在化するPolo様キナーゼの基質は全くの不明であったが、今回の解析からSpc7という動原体因子が同定され、さらにそのリン酸化をMph1と異なるタイミングでシェアするという、時空間的な制御機構も明らかになった。また、分裂酵母とマウスという、離れた種間においてもこれらの制御機構は保存されていることが示唆されたことは、より普遍的なメカニズムに迫っており、非常に大きな成果であると言える。もう一方の“一方向性結合”の制御についても、やはりMoa1-Plo1の機能が必須の役割を果たしている。今回明らかになったSpc7のリン酸化は、一方向性結合の制御には関わっていないことが判明している。よって、一方向性結合の制御には、さらに異なるPlo1の基質の存在を示唆しており、その同定が今後の課題である。
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| Strategy for Future Research Activity |
一方向性結合の制御に関わるPlo1の基質同定が喫緊の課題であると認識している。分裂酵母のセントロメアは高等真核生物と同様に動原体形成部位(中央領域)とその両側に存在するヘテロクロマチン領域という異なる機能ドメインによって構成されている。一方向性結合の確立に必要なMoa1-Plo1や、Rec8コヒーシンによる接着部位はこの中央領域である。加えて、Moa1によって動原体へと局在したPlo1をTEV proteaseによって特異的に切断分解するとmoa1破壊株と同様に減数第一分裂の還元分配が均等分配へとシフトしてしまう。さらに、moa1破壊株においてPlo1を動原体へと異所的に局在化させると、Plo1のリン酸化活性依存的にmoa1破壊によって失われた中央領域における接着が回復する。よって、Plo1によるリン酸化を介して接着の確立に機能する因子も中央領域で近接して存在していると予想される。その様な因子の中で最も有力な標的候補は、Rec8コヒーシン複合体そのものである。よって、Rec8コヒーシン複合体の各サブユニットの組換えタンパクを調製し、それらに対してPlo1によるin vitroでのリン酸化を行い、リン酸化される因子に関してはその標的残基の同定を行う。並行して、減数分裂期のセントロメアからRec8コヒーシン複合体を精製し、MS-MS解析によってリン酸化残基を同定し、それらがPlo1依存性かさらには一方向性結合の制御に関与するかを検証する。この様な一連の解析を通じて、一方向性結合の確立、ひいては還元分配に必須なPlo1の基質同定を図る。
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| Causes of Carryover |
セントロメア周辺に存在するコヒーシン複合体を精製し、減数分裂期細胞内におけるリン酸化残基を決定するSILAC法を含めた実験系を確立するための予備実験を経て、可溶化条件の設定を行っていたところ、対象とするコヒーシンタンパクが特殊な性質を持つため、条件の設定が予想外に困難なことが判明した。その結果、さらなる条件検討を行った上で条件設定を再度行う必要が生じたため実験企画の遅延が生じ、それに伴い未使用となった予算を次年度へと繰り越すこととなった。今後は、コヒーシン複合体の可溶化条件の検討と、大量精製方法の確立を引く続き検討することで、コヒーシン複合体のPlo1による標的残基の網羅的な同定を試みる。また、SILAC法によるリン酸化部位同定が難航すること、すなわち細胞内から高純度でコヒーシン複合体を精製、リン酸化部位を同定する作業の難易度を鑑み、組換えタンパクを用いた複合体の再構成系を利用し、それら組換え複合体に対して、in vitroでのリン酸化により、Plo1の網羅的な標的残基同定を試みることで、目的遂行に繋がるバックアップ実験も動かしていく計画である。
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