2014 Fiscal Year Annual Research Report
Small RNAを利用した次世代順遺伝学スクリーニング系の開発とその応用
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26712006
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (60560779)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 植物ウイルス / RNAサイレンシング / 順遺伝学スクリーニング / 宿主因子 / tasiRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、ランダムtasiRNAライブラリーの構築を行った。はじめに、Arabidopsis thalianaのTAS1c遺伝子のD3(+)、D4(+)の二ヶ所から二種類のランダムtasiRNAを発現させるためのTAS1c-D34ベクターを構築した。このTAS1c-D34ベクターにランダムなtasiRNAを挿入することに成功した。30コロニーの大腸菌よりプラスミドを抽出し、挿入された60種類の人工tasiRNA配列の標的mRNAを予測した。その結果、得られた人工tasiRNAの約半分には標的mRNAが無いことが判明した。
この結果を受けて、当初の計画を変更し、TAS1cのD2(+)、D3(+)、D4(+)の三ヶ所から三種類の人工ランダムtasiRNAを発現させるように改変したTAS1c-D234ベクターを構築した。このベクターにも人工ランダムtasiRNAを挿入することに成功した。30コロニーの大腸菌よりプラスミドを抽出し、挿入された90種類の人工tasiRNAの標的mRNAを予測した、その結果、各コンストラクトあたり少なくとも一つのmRNAを標的とする人工tasiRNAをもつ集団が構築できたことが明らかとなった。これらの結果より、改変TAS1c-D234ベクターを用いてランダムtasiRNAベクターを作成することにした。
次に、ランダムな人工tasiRNAをもつプラスミドをエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウムに形質転換し、選択培地上で生育させたアグロバクテリウムの各コロニーがランダムなtasiRNAを含むかどうかを評価した。30コロニーのアグロバクテリウムより人工tasiRNA領域を増幅し、シークエンス解析を行った。その結果、ランダムな外来tasiRNAをもつアグロバクテリウムライブラリーの構築に成功したことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
植物育成室にアザミウマが大量発生し、一旦すべての植物を廃棄することになったため。二種類の農薬を利用するなど、防虫対策を施した。
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| Strategy for Future Research Activity |
一年目の研究計画分の遅れを取り戻すべく、植物育成棚の増設を行う。また、より効率よくウイルスの感染を評価するために、GFPを用いてCMVの増殖を可視化する。
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| Causes of Carryover |
先の項で述べた通り、実験の進展が当初計画より遅れたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
スクリーニングを効率よく進めるために、GFPを用いてCMVの感染を可視化する。CMV感染の有無・効率を評価するために実体蛍光顕微鏡を導入する計画である。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Roles and programming of Arabidopsis ARGONAUTE proteins during Turnip mosaic virus infection2015
Author(s)
Garcia-Ruiz H., Carbonell A., Hoyer S. J., Fahlgren N., Gilbert K. B., Takeda A., Giampetruzzi A., Garcia-Ruiz M. T., McGinn M. G., Lowery N., Baladejo M. T. M. and Carrington J. C.
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Journal Title
PLoS Pathogens
Volume: 11
Pages: e1004755
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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