2014 Fiscal Year Annual Research Report
高選択的新規抗生物質開発を目指した特殊制限酵素の構造基盤解明と薬剤探索
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26712012
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
宮園 健一 東京大学, 農学生命科学研究科, 特任助教 (90554486)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 制限酵素 / X線結晶構造解析 / DNAグリコシラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、R.PabIに代表されるhalf pipe型制限酵素によるDNA認識及び切断機構の構造基盤解明を通じて、それらの酵素活性を狂わすような化合物を構造情報に基づいて設計することを目的としている。そのような化合物は、half pipe型制限酵素を持つHelicobacter属及びCampylobacter属に対して非常に選択性の高い抗生物質となりうる。そこで本年度は、half pipe型制限酵素のモデルタンパク質である古細菌由来half pipe型制限酵素R.PabIを研究対象とし、そのDNA認識及び切断機構の全様を解明すべくX線結晶構造解析法による構造決定を行った。その結果、R.PabIと認識配列を含む二本鎖DNAの複合体構造及び、R.PabIと認識配列を含まない二本鎖DNAの複合体構造を、それぞれ、3.0Å及び1.9Åの分解能で決定することに成功した。
R.PabI-配列特異的二本鎖DNA複合体構造解析の結果、R.PabIは、5’-GTAC-3’という認識配列のうちグアニン及びアデニン塩基をDNA二重鎖から排出することにより特異的な配列認識を行い、そのうちのアデニン塩基を保存された二つの残基（Y68, D214）による触媒作用によって加水分解する活性（DNAグリコシラーゼ活性）を持つことを明らかにした（Nat Commun. 5:3178 (2014)）。一方、R.PabI-配列非特異的二本鎖DNA複合体構造解析の結果からは、R.PabIは二本鎖DNA依存的に四量体様の構造を形成し、二本鎖DNA上を効率よくスライドしながら認識配列を探索する機構をもつことが示唆された。これらのR.PabI-DNA複合体の構造解析から得られた知見は、他の制限酵素では全く見られなかった、非常に特徴的な機構であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度の研究では、R.PabI-配列特異的DNA複合体及びR.PabI-配列非特異的二本鎖DNA複合体のX線結晶構造解析に成功し、half pipe型制限酵素のモデルタンパク質であるR.PabIが、非特異的な二本鎖DNAのプールの中から特定の認識配列を探索する機構や、特定の認識配列部位において二本鎖DNAの構造を大きく変化させることにより活性を示すことなどを明らかにすることができた。平成27年度に計画していたR.PabIの変異体解析はほぼ平成26年度中に完了し、R.PabI-配列特異的二本鎖DNA複合体の解析に関してはすでに論文や学会発表として、研究発表を行っている。また、R.PabI-配列非特異的二本鎖DNA複合体の解析に関しても、論文投稿に必要なデータの取得がほぼ完了しており、現在論文としてまとめている段階にある。以上のように、R.PabIと配列特異的及び配列非特異的二本鎖DNAの複合体構造解析に関しては、当初予定していた以上に研究が進捗している。一方、平成26年度はR.PabIの解析に注力したため、平成26年度に予定していたHelicobacter属及びCampylobacter属由来half pipe型制限酵素の解析に関しては、これまでに明確な成果が得られていない。平成27年度に予定していたR.PabIを対象とした研究が、平成26年度中に前倒しで行えたため、平成27年度はHelicobacter属及びCampylobacter属由来half pipe型制限酵素の解析に集中できると考えている。以上の理由から、本研究の達成度を「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
half pipe型制限酵素のモデル分子であるR.PabIに関しては、その構造・機能解析が平成26年度中にほぼ完了したため、平成27年度はHelicobacter属やCampylobacter属等の病原菌に由来するhalf pipe型制限酵素の構造・機能解析を行う。Helicobacter属及びCampylobacter属由来half pipe型制限酵素と二本鎖DNAの複合体構造をX線結晶構造解析法により決定することにより、これらのタンパク質に特徴的なDNA認識機構を解明する。生細胞を利用した組換えタンパク質大量発現実験において、目的タンパク質の発現が見られなかった場合や、結晶が得られなかった場合は、ホモログタンパク質の利用を検討する。また、組換えタンパク質を大量発現させた際に、封入体としてのみ発現が見られた場合、高圧環境を利用した巻き戻し実験を利用し、可溶化したタンパク質として回収することを試みる。タンパク質単独及びそのDNA複合体の結晶が得られた場合、大型放射光施設（Photon FactoryやSPring-8）においてX線回折データの取得を行い、分子置換法、同型置換法、異常分散法等によってその立体構造を決定する。
Helicobacter属及びCampylobacter属由来half pipe型制限酵素と二本鎖DNAの複合体構造が早期に決定できた場合、当初平成28年度に実施を計画していた、化合物ライブラリに対するドッキングシミュレーションを行い、酵素機能を調節しうる化合物の絞り込み研究を前倒しで行う計画である。
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| Causes of Carryover |
今年度は、古細菌由来half pipe型制限酵素R.PabIの研究で非常に大きな進展が見られたため、研究の多くをR.PabIの解析に費やした。そのため、当初予定していたHelicobacter属及びCampylobacter属等の病原菌由来half pipe型制限酵素の解析が当初の予定よりも十分に進捗しておらず、その結果、病原菌由来half pipe型制限酵素の解析のために見積もっていた予算の一部が次年度使用額として生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
病原菌由来half pipe型制限酵素の解析のための物品費として利用する。
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