2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26713011
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
川根 公樹 京都産業大学, 総合生命科学部, 准教授 (60362589)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞死 / 上皮細胞 / 腸管 / 細胞脱落 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
上皮細胞は組織から脱落してその一生を終える。死ぬべき細胞は隣接細胞が生み出す力により押し出され、組織から脱落する。本研究は、腸上皮のターンオーバーでの脱落を対象に、以下のアプローチを用いて脱落の分子機構の解明を行うものである。(A) 時間経過が細胞にもたらす変容をオミクス解析により明らかにし、寿命を迎えた細胞に何がおこり脱落のタイミングが決定されるかを明らかにする。(B) 脱落運命の決定された細胞はどのように隣接細胞に感知され、隣接細胞はどのように細胞を押し出すためのアクチンリングの形成を開始するかを明らかにする。ここではショウジョウバエにおいて新規RNAiスクリーニング系を用いる。(C) アクチンリングのどのような動態変化が力を発生して細胞を押し出すのか、その際細胞間接着がどのように喪失、再形成されるかをマウス腸培養組織、オルガノイドを用いたライブイメージングによって解明する。
H26年度実績の内、特に(B),(C)について記載する。
(B) 私の樹立したシステムは上皮において優れたスクリーニングツールとなることを確認しているが、これが腸上皮においてもワークするかを検討した。腸ではクローンの誘導率が低いことが問題となったが、クローンを誘導するためのヒートショックを施すタイミング及び回数等を最適化することで十分なクローンの誘導率を達成した。双子クローンでの各GFP, RFPは、十分な輝度を持って検出され、各クローン内の細胞数が染色なしに測定出来るとわかった。
(C) 腸オルガノイドの系をたちあげ、初めてとなる脱落のライブイメージングに成功した。これにより脱落の開始から完了までの時間は数十分とわかった。この時、脱落する細胞はアポトーシスマーカー陰性であることが示され、細胞は生きたまま脱落すると考えられる。各種タンパク質(細胞骨格や細胞接着分子等)の分子動態を解析するため、蛍光タンパク質との融合タンパク質の発現株を樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究実績の概要の欄に記載したように、研究計画(C)において、改善すべき点が予想以上に見出されたため、これらの解決に時間を要したので「(3) やや遅れている」 の区分としたが、まもなく実際のスクリーニングを開始する予定である。また、(A),(B)に関しては概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
H27年度は、研究実績の概要の欄に記載した(A)-(C)のアプローチに対し、以下のように研究実施を計画する。
(A) オミクス解析を行うため、マウス腸上皮またはオルガノイドから、若い細胞及び古い細胞を細胞標識とセルソーティングによって分取する。分取が困難であるようならば、マウス腸上皮の組織切片を用いたマイクロダイセクションを用いる代替案なども検討する。
(B) H26年度に行った、スクリーニング実験の条件の最適化に続いて、脱落の実行装置の構成分子ミオシンなど脱落に重要である可能性が非常に高い5つの遺伝子のノックダウンをこの系を用いて行う。そしてフローサイトメトリーあるいは腸組織の共焦点顕微鏡での観察によって、GFP陽性, RFP陽性細胞数 (用いる新規スクリーニング法では、双子のGFPクローンとRFPクローンの内、RNAiが発現するGFPクローンの細胞数が脱落の寡多により過乗または不足となる表現型をスクリーニング対象とする)を算出し、脱落異常の表現型が評価できるかを最終確認する。その後、候補アプローチ及び無作為抽出により1000の遺伝子を選び、スクリーニングを開始する。
(C) マウス腸オルガノイドの実験系において、分子動態をイメージングするためのプローブ (細胞接着分子と蛍光タンパク質の融合タンパク質など)を用い、細胞が脱落する過程でのこれらの動態を解析する。また、並行してオルガノイドでの細胞脱落を定量する実験系の構築を行う。
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| Causes of Carryover |
当初、ショウジョウバエ解剖用に高性能オリンパス実体顕微鏡の購入を予定していたが、技術等の習熟によって、既に所有していた実体顕微鏡でも十分目的にたえうる状況となり、新規購入を行わなかった。また、抗体、培養試薬等の物品 (消耗品)に、他の研究課題と共通で使用するものがあり、それらの一部を他の研究資金で購入出来た。
これらの理由により、本年度の研究によって実施が可能となったスクリーニング実験を迅速かつ大規模に進めるため、上記の額について、本年度よりも次年度に使用することが望ましいと考えた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、ショウジョウバエライブラリーを用いたスクリーニングを実施するため、ショウジョウバエ各系統の購入費、これらの飼育、維持費が必要となる。繰越額をこれにあて、またアルバイトを雇用してこの実験に参画してもらうことで、次年度のスクリーニング実験がより迅速に進展することが期待出来る。
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