2014 Fiscal Year Annual Research Report
機能的な制御性T細胞のin vitro創出を目指したCD4T細胞分化機構の研究
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26713019
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
関谷 高史 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (80519207)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 免疫学 / 自己免疫疾患 / エピジェネティクス / 制御性T細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. Nr4aを制御性T細胞（Treg）特異的に欠損させたマウスは自己免疫疾患を発症することを見出した
Nr4aはTregの分化において必須であることを先行研究で見出したが、その発現は分化後のTregでも高く維持されることが明らかとなっている。従ってTregで特異的にCreリコンビナーゼを発現し、Nr4a遺伝子の欠損が引き起こされるマウス（Nr4a-Treg-TKOマウス）を構築した。このマウスは多臓器性の自己免疫疾患を発症し、多くのマウスは生後5ヶ月以内に死亡することを明らかとした。このマウスではIgE, IgG1アイソタイプの抗体価が著明に上昇しているうえ、自己反応性抗体の産生亢進が見られたため、Th2型やTfh型ヘルパーT細胞の活性化が示唆された。これらの結果から、Nr4aは分化後のTregでも重要な役割を担っていることを明らかとした。
2. Nr4aを欠損したTregは遺伝子発現の異常を示すことを見出した
Nr4aを欠損したTregをNr4a-Treg-TKOマウスから単離し、マイクロアレイ解析を行ったところ、Nr4a欠損TregではFoxp3やEos等のTregで主要な遺伝子群の大部分が発現低下を示した一方、IL4, IL13, IL21等、Th2型やTfh型ヘルパーT細胞の機能において重要なサイトカイン遺伝子の著明な発現亢進が認められた。さらにクロマチン免疫沈降産物を次世代シークエンサーにより網羅的に解析した結果、Nr4aはFoxp3やEos, IL4, IL21遺伝子のプロモーターやエンハンサー部位に結合することを明らかとした。これらの結果から、Nr4aはTregにおいて発現されるべき遺伝子、抑制されるべき遺伝子群の多くをそれぞれ直接発現誘導および抑制していることを明らかとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当研究の目的は ①多段階で進行し、多数の遺伝子が発現制御を受けるTreg分化プログラムのうち、どの部分がNr4aに担われるか？ ②Nr4aの活性強度が中程度の時はTregが誘導され、強度の時はネガティブセレクションが誘導されるが、それぞれにおける転写標的遺伝子は何か？③ Nr4aと共役し機能する因子は何か？という、大きく３つの疑問点の解決に分けられる。
①の解明を目的とした研究に関しては、現在までのところ、マイクロアレイ法による解析により、Nr4aにより担われる転写誘導プログラム、転写抑制プログラムを既に網羅的に明らかとしている。その結果、Nr4a欠損細胞では、Treg分化における転写プログラムの多くは正常に進行することが明らかとなったが、分化形質が非常に不安定であることも見出した。次に、Treg分化における重要な分子イベントの一つとして部位特異的なCpG脱メチル化が挙げられる。特異的脱メチル化を受ける遺伝子部位としてFoxp3, Tnfrsf18, Ctla4, Ikzf4, Ikzf2, Il2ra部位が同定されているが、本研究ではFoxp3遺伝子座の解析を既に完了している。以上の結果から、①に関連する目的は、半分以上が達成されたと言える。
次に、②の解明を目的とした研究では、Nr4a欠損細胞では、ネガティブセレクションにおいて必須の役割を担う、アポトーシス誘導遺伝子Bcl2l11(Bim)の発現が著明に低いことを見出した。本研究では、このBimがNr4aが誘導するネガティブセレクションのエフェクター因子である可能性を引き続き追求している。
次に、③の解明を目的とした研究では、ショットガン質量分析によりNr4aの相互作用因子の網羅的な同定が完了している。
以上、本研究はオミクス解析を既に終了しており、個々の因子の詳細な解析の段階に入ったと言え、当初の計画以上に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の主な3つの目的 である、①多段階で進行し、多数の遺伝子が発現制御を受けるTreg分化プログラムのうち、どの部分がNr4aに担われるか？ ②Nr4aの活性強度が中程度の時はTregが誘導され、強度の時はネガティブセレクションが誘導されるが、それぞれにおける転写標的遺伝子は何か？③ Nr4aと共役し機能する因子は何か？という、大きく３つの疑問点の解決は、今後それぞれ以下の方策により推進していく予定である。
①の解明を目的とした研究に関しては、Foxp3以外の5つの遺伝子座の解析を進め、Treg特異的脱メチル化におけるNr4aの役割の全貌を解明する。また、Nr4aを欠損した細胞では、Treg分化プログラムは開始されるが、すぐにその分化形質を失うことを示したが、本研究ではこの分化形質を失った後の細胞の特徴付けを行う。現在までの研究では、これらの細胞は炎症性サイトカインを高発現する上、生存も亢進していることを明らかとしている。従ってこれらの細胞は、現在まで見出されてこなかった、Treg前駆細胞の脱分化により生じた新たな炎症惹起性細胞サブセットである可能性を示唆しているため、その解明を試みる。
②現在までの研究でBimがNr4aによるネガティブセレクションのエフェクター因子である可能性を見出しているため、この分子の発現量解析や発現制御を様々な細胞種で試みる。
③現在までの研究で、Nr4aと相互作用する因子を複数見出している。それらの因子の中でも、特にT細胞分化との関連性が解明されている因子やヒト炎症性疾患との関連性が解明されている因子に着目し解析することで、Nr4aの制御異常が引き起こすT細胞制御異常とヒト炎症性疾患との関連性の解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
クロマチン免疫沈降-次世代シークエンサー解析（ChIP-seq解析）の実施を予定していたが、当該年度中でのサンプル調製が間に合わないものがあった。また、マイクロアレイ解析の実施を予定していたが、当該年度中でのサンプル調製が間に合わないものがあった。
これらの解析に対する費用を予定額に計上していたため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上述ChiP-seq解析、マイクロアレイ解析用サンプルは調製が完了したため、本年度予算で解析を実施する予定である。
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