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2015 Fiscal Year Annual Research Report

逆ドラッグデザイン法の確立とポリグルタミン病分子治療薬の開発

Research Project

Project/Area Number 26713030
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

武内 敏秀  京都大学, 化学研究所, 助教 (70600120)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywordsポリグルタミン病 / ドラッグデザイン
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ポリグルタミン(PolyQ)タンパク質に選択的結合活性、凝集阻害活性を有するペプチドQBP1の構造情報をもとにして、凝集阻害化合物の開発を目指す。この目的において、PolyQタンパク質と複合体を形成した状態におけるQBP1の立体構造解析を行った。これまでに、QBP1ペプチドの15Nラベル体(15N-QBP1)、およびモデルPolyQタンパク質(チオレドキシン融合体、Thio-PolyQ)の大腸菌発現系を用いた調製法を確立した。また、等温滴定型カロリメトリーにより、QBP1とThio-Q62との結合モードに関する知見を得た。この結果に基づいて、15N-QBP1をThio-Q62と複合体を形成させ、NMR測定を試みた。しかし、Thio-Q62が測定中に微細な凝集体を形成し、15N-QBP1もこれに取り込まれるため、NMR測定が困難であることが示唆された。Thio-Q62の代わりに、より凝集性の低い短鎖PolyQタンパク質であるThio-Q45、Thio-Q35を用いたが、同様に測定が困難であった。これらの検討から、凝集性のより低いPolyQタンパク質の調製がNMR測定に必要であることが示唆された。また、薬物を脳内にデリバリーする手法の開発を目指し、細胞移行性ペプチドPTDのin vitroにおける網羅的BBB透過性評価を行った。その結果、複数のBBB透過性PTDを同定したため、ラットにおいて検討を行ったところ、そのうちの一種について高い脳内移行性を確認した。一方、分子シャペロンと呼ばれる防御因子がPolyQタンパク質の凝集を抑制し、神経変性を抑制することが知られているが、ショウジョウバエ個体を用いた検討から分子シャペロンが細胞非自律的に神経変性を抑制することを見出し、論文発表を行った(Takeuchi et al, PNAS 2015)。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度に引き続き、構造解析に必要な試料調製および実験系の立ち上げが順調に進んだ。これまでに明らかとなったNMR測定上の問題点を踏まえ、QBP1の構造を明らかしていく。一方、PTDのスクリーニングから脳内移行性キャリア分子の候補を得ている。また、PolyQ凝集に着目した検討から分子シャペロンの細胞非自律的な機能を見出し、論文発表した。総合的に考え、概ね順調と言える。

Strategy for Future Research Activity

これまでの検討から、Thio-PolyQが測定中に微細な凝集体を形成し、15N-QBP1もこれに取り込まれるため、NMR測定が困難であることがわかった。そこで本年度では、チオレドキシンの代わりに、より凝集性の低いグルタチオン-S-トランスフェラーゼやマルトース結合タンパク質などを融合タグタンパク質として用い、これらとの融合PolyQタンパク質を調製し、再び15N-QBP1のNMR測定を行う。これらの解析により、凝集抑制活性に必須のQBP1の立体構造・側鎖配置に関する情報を得る。また、Thio-PolyQとの複合体形成時におけるQBP1の立体構造を模倣し、凝集抑制に必須な構造条件を満たす低分子凝集阻害化合物(QBP1アナログ)をin silicoで設計する。候補分子のうち、高い活性が期待され、合成が比較的容易なものを複数選択して合成し、in vitro凝集濁度アッセイにより凝集阻害活性を評価する。また、薬物を脳内にデリバリーする手法の開発を行う。これまでに同定したBBB透過性PTDをキャリア分子として活用し、薬物モデルとしてQBP1を脳内移行させることが可能かを検討する。PTD-QBP1コンジュゲート体を作製し、これがマウスへの末梢投与で脳内に検出可能かどうかについて、投与法や投与量などを変えて詳細に調べる。

Causes of Carryover

PolyQ/QBP1複合体のNMR測定を行ったが、QBP1の構造決定までは至らなかった。そのため、QBP1の小分子アナログの設計・合成まで実験が進まなかったため、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度においてQBP1の小分子アナログの設計・合成を行うための物品費に使用する。

  • Research Products

    (12 results)

All 2016 2015

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 1 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results) (of which Overseas: 2 results)

  • [Journal Article] Intercellular Chaperone Transmission via Exosomes Contributes to Maintenance of Protein Homeostasis at the Organismal Level.2015

    • Author(s)
      Takeuchi T., Suzuki M., Fujikake N., Popiel H.A., Kikuchi H., Futaki S., Wada K., and Nagai Y.
    • Journal Title

      Proc. Natl. Acad. Sci. USA

      Volume: 112 Pages: E2497-2506

    • DOI

      10.1073/pnas.1412651112

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Glucocerebrosidase Deficiency Accelerates the Accumulation of Proteinase K-Resistant α-Synuclein and Aggravates Neurodegeneration in a Drosophila Model of Parkinson’s disease.2015

    • Author(s)
      Suzuki M., Fujikake N., Takeuchi T., Kohyama-Koganeya A., Nakajima K., Hirabayashi Y., Wada K., and Nagai Y.
    • Journal Title

      Human Molecular Genetics

      Volume: 24 Pages: 6675-6686

    • DOI

      10.1093/hmg/ddv372.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Cell Penetrating Peptides for Chemical Biological Studies.2015

    • Author(s)
      Nakase I., Takeuchi T., and Futaki S.
    • Journal Title

      Methods in Molecular Biology

      Volume: 1324 Pages: 387-396

    • DOI

      10.1007/978-1-4939-2806-4_26.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Hsp70の機能欠損体が示す細胞非自律的な変性抑制2016

    • Author(s)
      武内敏秀、鈴木マリ、坂井聖子、二木史朗、和田圭司、永井義隆
    • Organizer
      日本薬学会 第136年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2016-03-26 – 2016-03-29
  • [Presentation] Syndecan-4 as a Possible Octaarginine Receptor for its Clathrin-Mediated Endocytic Uptake.2016

    • Author(s)
      Takeuchi T., Kawaguchi, Y., Kuwata, K., Futaki, S.
    • Organizer
      統合物質創製化学推進事業 第5回国際シンポジウム
    • Place of Presentation
      名古屋(名古屋大学)
    • Year and Date
      2016-01-29 – 2016-01-30
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 分子シャペロンのエクソソームを介した細胞間伝播による細胞非自律的なタンパク質の恒常性維持機構2015

    • Author(s)
      武内敏秀、鈴木マリ、藤掛伸宏、ポピエル明子、菊地寿枝、二木史朗、和田圭司、永井義隆
    • Organizer
      第10回臨床ストレス応答学会大会
    • Place of Presentation
      東京(東京農工大学)
    • Year and Date
      2015-11-06 – 2015-11-07
  • [Presentation] 分子シャペロンはエクソソーム細胞間伝播により細胞非自律的な治療効果を発揮する2015

    • Author(s)
      武内敏秀、永井義隆
    • Organizer
      第34回日本認知症学会学術集会
    • Place of Presentation
      青森(リンクステーションホール青森ほか)
    • Year and Date
      2015-10-02 – 2015-10-05
    • Invited
  • [Presentation] 分子シャペロンはエクソソームを介した細胞間伝播により個体レベルのプロテオスターシス維持に寄与している2015

    • Author(s)
      武内敏秀、鈴木マリ、藤掛伸宏、ポピエル明子、菊地寿枝、二木史朗、和田圭司、永井義隆
    • Organizer
      第7回日本RNAi研究会・第2回日本細胞外小胞学会
    • Place of Presentation
      広島(グランドプリンスホテル広島)
    • Year and Date
      2015-08-26 – 2015-08-28
  • [Presentation] Intercellular chaperone transmission via exosomes contributes to non-cell autonomous therapeutic effects on polyglutamine disease models2015

    • Author(s)
      武内敏秀、鈴木マリ、藤掛伸宏、ポピエル明子、菊地寿枝、二木史朗、和田圭司、永井義隆
    • Organizer
      第38回日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      神戸(神戸コンベンションセンター)
    • Year and Date
      2015-07-28 – 2015-07-31
  • [Presentation] 抗体の細胞内送達を実現する天然毒素ペプチドの配列改変2015

    • Author(s)
      武内敏秀、秋柴美沙穂、川口祥正、二木史朗
    • Organizer
      日本ケミカルバイオロジー学会 第10回年会
    • Place of Presentation
      仙台(東北大学)
    • Year and Date
      2015-06-10 – 2015-06-12
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 血液脳関門透過性ペプチド2016

    • Inventor(s)
      武内敏秀、永井義隆、中川慎介、丹羽正美、道具伸也、他2名
    • Industrial Property Rights Holder
      武内敏秀、永井義隆、中川慎介、丹羽正美、道具伸也、他2名
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      PCT/JP2016/058406
    • Filing Date
      2016-03-16
    • Overseas
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞質送達ペプチド2015

    • Inventor(s)
      二木史朗、秋柴美沙穂、川口祥正、武内敏秀
    • Industrial Property Rights Holder
      二木史朗、秋柴美沙穂、川口祥正、武内敏秀
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      PCT/JP2015/077395
    • Filing Date
      2015-09-28
    • Overseas

URL: 

Published: 2017-01-06  

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