精細管再構成によるin vitro精子形成法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26713049
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 奥田 英伸 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特別研究員(PD) (00625452)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 精子形成 / セルトリ細胞 / 遺伝子導入 / レンチウイルス

Outline of Annual Research Achievements

１．Direct reprogrammingに必要な遺伝子群のcloning及びレンチウイルス発現ベクターの確立；マウス精巣よりPCR法により上記に必要な５個の遺伝子群をcloningした。それらをGateway systemを利用して、レンチウイルス発現ベクターに挿入した。
２．Mouse embryonic fibroblast(MEF)及びMesenchymal stem cell(MSC)の採取・培養系の確立；MEFに関してdpc14.5daysのICR mouseより胎児を摘出し、さまざまな処理を行ったうえで、single cell化し、適切な条件下にて培養を行った。MSCに関してadult ICR mouseの腹部脂肪層を摘出し、single cell化し同様に培養を行った。
３．レンチウイルス粒子の形成・濃縮：１で作成したレンチウイルスベクターを29ウイルス粒子構成因子発現ベクターとともに293FT cellにトランスフェクションし、ウイルス粒子を生成した。その後これらのウイルス粒子を含む培養上清を回収し、超遠心分離により濃縮を行った。
４．MSC及びMEFの遺伝子導入によるDirect reprograming；上記で得たウイルス粒子の感染力価を測定したのち、MSCとMEFにMOI3-5でレンチウイルスを感染させた。感染後、遺伝子導入によりDirect reprogramingを起こした細胞は著名な増殖能を示し、コロニーを形成した。これらのコロニーをそれぞれ回収し、induced embryonic Sertoli-like cellの候補細胞株として培養を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の計画書にしたがって研究を進めている。様々な困難があったものの、予定していた実験計画は達成できたと考える。

Strategy for Future Research Activity

１．induced embryonic Sertoli-like cellsの機能解析
平成２６年度の研究により、レンチウイルスで特定の遺伝子を導入し、形質転換を起こしたMEFのコロニーが複数系統得られた。これらの細胞株について、Setoli cell特異的マーカーの発現をReal-time PCRで検討する。さらにembryonic Sertoli cellの表面マーカー（CD56など）を用いてcell sortingを行い、より良好なDirect reprogrammingを起こした細胞を回収する。こうして得られた細胞の精細胞の維持に必須のサイトカインの分泌についてもELISAや免疫染色を用いて検討を行う予定である。
２．GS cell(Germline stem cell)の樹立
内在性のSpermatogonial stem cellと区別するために、GFP発現GS cellを樹立する。GFP transgenic mouse単独からのGS cellの樹立は非常に困難であるため、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)XDBA/2F1の新生仔の精巣からspermatogonial stem cellを回収し、GS cellを樹立する。GS cellとinduced embryonic Sertoli-like cellsの共培養を行い、FGFやGDNFなどのGS cell維持に必須のサイトカインの添加のない条件で、GS cellが維持できるかを検討する。

Causes of Carryover

特別研究員PDの奨励費で購入した試薬や器具を本研究においても共通品として使用することができた。またその他必要物品や機器の維持費も研究室内の共有物品でまかなうことができたため、次年度に本予算を持ち越しして、物品購入や機器の維持管理費に使用したい。

Expenditure Plan for Carryover Budget

計画書通りに研究を進めていく。来年度は培養実験が中心となるため、その試薬や物品を中心に購入費として使用する。またマウスを用いた動物の維持費や実験の物品費に当てていく予定である。