2015 Fiscal Year Research-status Report
ＤＮＡ損傷修復蛋白質ＸＲＣＣ４の脱リン酸化がアポトーシス促進の引き金となるか
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26740020
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
砂谷 優実 金沢医科大学, 医学部, 助教 (70581057)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アポトーシス / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷修復蛋白質XRCC4は、非相同末端結合修復能についてはよく解析されているが、他の機能はよく分かっていない。これまでに、XRCC4はアポトーシス時にAsp265でカスパーゼに切断されてN末端側35 kDaの断片（p35）になることが報告されている。私は、マウスリンパ腫由来XRCC4欠損M10細胞株に、野生型、カスパーゼで切断されない変異型、あるいはThr233がリン酸化されない変異型のXRCC4を発現させた細胞株を用いて、カスパーゼによる切断依存性および（あるいは）Thr233リン酸化依存性に、XRCC4がアポトーシスを促進することを明らかにした。さらに、この促進がDNA-PK活性依存性であること、およびp35はアポトーシス刺激後に脱リン酸化されることを見出した。本研究では、XRCC4Thr233リン酸化から脱リン酸化への変換がアポトーシス促進の引き金となることを証明することを目的としている。
平成27年度は、以下1～3を計画し、実施した。
1.XRCC4Thr233のリン酸化およびp35Thr233の脱リン酸化がアポトーシス促進に関与することを結論付ける、2.アポトーシスにおけるThr233の責任リン酸化酵素および脱リン酸化酵素を同定する、3.Thr233非リン酸化型p35を強制発現させることで、放射線あるいは抗がん剤に抵抗性を示すがん細胞が感受性となるかを検証する。
1.については、昨年度までの結果に加え、リン酸化あるいは脱リン酸化されないp35発現ベクターを導入したXRCC4発現細胞でアポトーシス促進がみられないことから、XRCC4Thr233のリン酸化およびアポトーシス刺激後に生じるp35Thr233の脱リン酸化がアポトーシス促進の引き金となるとの結論に至った。2.については、リン酸化酵素・脱リン酸化酵素阻害剤を複数種用いたスクリーニングにより、責任リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の候補を同定した。現在は3.に取りかかろうとしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度では、以下の3項目を計画していた。
1.XRCC4Thr233のリン酸化およびp35Thr233の脱リン酸化がアポトーシス促進の引き金となることを結論付ける、2.アポトーシスにおけるThr233の責任リン酸化酵素および脱リン酸化酵素を同定する、3.放射線抵抗性がん細胞にThr233非リン酸化型p35を強制発現させることで、放射線感受性を付与できるかの検証に取りかかる。
1.については、XRCC4発現細胞に脱リン酸化状態とならない偽リン酸化型p35発現ベクターを導入しても、アポトーシスが亢進しないという結果が得られた。この結果および平成26年度までに得られたXRCC4Thr233の脱リン酸化がカスパーゼによる切断依存性である結果を踏まえ、XRCC4Thr233のリン酸化およびアポトーシス刺激後に生じるp35Thr233の脱リン酸化の両反応が、アポトーシスの促進の引き金となるとの結論に至った。
2.については、リン酸化酵素・脱リン酸化酵素阻害剤を複数種用いたスクリーニングにより、責任リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の候補を同定した。
現在は、3.を行おうと計画している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度は、放射線抵抗性がん細胞にThr233非リン酸化型p35を強制発現させることで、放射線感受性を付与できるかを検証する。
まず、Tet-off systemを用いてテトラサイクリン濃度依存性にThr233非リン酸化型p35の発現量を調整できる放射線抵抗性がん細胞株を樹立する。細胞株としてヒト骨肉腫細胞由来U2OS細胞株を用いる予定である。次に、樹立した細胞株に放射線あるいは抗がん剤によりアポトーシスを誘導して、その程度とp35の発現量に正の相関があるかを調べる。
これまでに見出したXRCC4を介したアポトーシス促進機構は、DNA損傷非依存性のアポトーシスで効果を発揮することが既にわかっていることから、放射線照射やDNA損傷性抗がん剤で誘導したアポトーシスでは期待される結果が得られないことが予想される。そこで、DNA非損傷性抗がん剤処理でのアポトーシスについても同様に解析する。XRCC4を介したアポトーシス促進が検出されるDNA非損傷性抗がん剤は既に決定しており、計画に遅れが生じることはないと予想される。
最終的に、平成26年度から平成28年度までに得られた成果を当該分野関連学会および原著論文で発表する。
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