2014 Fiscal Year Research-status Report
マンネンタケ水抽出物に含まれる酵素の発現挙動および酵素化学的解析
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26750024
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| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
熊倉 慧 高崎健康福祉大学, 公私立大学の部局等, 助手 (80516930)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | きのこ / マンネンタケ / 酵素 / プロテアーゼ / グルコシダーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マンネンタケ（Ganoderma lucidum）は機能性が着目されるきのこであり、本年度は、機能性に関与すると考えられる酵素について、遺伝子のクローニング、完全長cDNA配列情報の取得、生育ステージにおける発現量解析を試みた。
その結果、液体培養菌糸体からのgDNA抽出とその増幅に成功した。得られたgDNAを鋳型にして、プロテアーゼおよびグルコシダーゼのクローニングを試みた。その結果、グルタミン酸プロテアーゼおよびエンド-β-1,3-グルカナーゼのクローニングに成功した。さらにシークエンシングにより、これらの遺伝子配列情報を取得した。得られた配列情報をもとに、培養菌糸体における遺伝子発現を確認した。その結果、グルタミン酸プロテアーゼ遺伝子の発現を確認した。そこで、グルタミン酸プロテアーゼの完全長cDNA配列情報の取得を試みた。液体培養菌糸体から得られたtotal RNAからcDNAを合成し、完全長cDNA配列情報を取得した。一方、菌糸体粗酵素抽出液中にプロテアーゼ活性も確認した。
マンネンタケ水抽出物に含まれる酵素の発現挙動の解析は、子実体水抽出物のプロテオーム解析が背景となっている。しかしながら、子実体水抽出物でのプロテアーゼおよびグルコシダーゼ活性は確認していない。そこでマンネンタケ子実体水抽出物におけるプロテアーゼおよびグルコシダーゼ活性について確認した。その結果、グルコシダーゼ活性はおいては、ラミナリンを基質として、その活性が確認された。また、プロテアーゼ活性においても、カゼインを基質として、その活性が認められた。
次いで子実体における発現量解析のために、マンネンタケ子実体の実験室スケールでの人工栽培を試みた。50mL容量のプラスティックチューブに木粉培地を充填し、菌糸体を培養した。現在、子実体原基形成を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養菌糸体からのgDNA抽出において高純度のgDNAの取得が困難であったこと、十分量のgDNAを取得するためにgDNA増幅を行う必要が生じたことなど、条件検討が必要となったことが理由としてあげられる。また、クローニングにおいて、プライマー設計も含めたPCR条件の検討が必要となった点があげられる。
子実体水抽出物および菌糸体でのプロテアーゼおよびグルコシダーゼ活性の確認が必要となり、実験を追加した点も理由としてあげられる。そして、これらの条件検討や実験追加により、マンネンタケ子実体の実験室スケールでの人工栽培への取り組みがやや遅れる結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究は、gDNAよりクローニングに成功したグルタミン酸プロテアーゼおよびエンド-β-1,3-グルカナーゼを中心に研究を推進する予定である。
グルタミン酸プロテアーゼに関しては、取得した完全長cDNA配列情報を解析する。子実体の栽培ができた後、菌糸体、子実体原基、そして収穫後までのステージおよび部位別のmRNAを回収し、リアルタイムPCRを用いて各ステージにおける発現量解析をおこなう予定である。また、目的遺伝子の完全長cDNAを大腸菌に組み込み、組換えタンパク質として目的酵素の取得を試みる。
エンド-β-1,3-グルカナーゼに関しては、子実体の栽培ができた後、菌糸体、子実体原基、そして収穫後までのステージおよび部位別のmRNAを回収し、リアルタイムPCRもしくはRT-PCRを用いて各ステージにおける発現解析をおこなう予定である。発現が確認されたステージにおいて、完全長cDNA配列情報の取得を試みる。
子実体人工栽培に関しては、引き続き、実験室スケールでの人工栽培における子実体形成を試みる。子実体形成が困難である場合は、発生処理から路地栽培に切り替え、子実体形成を試みる。
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| Causes of Carryover |
物品購入にあたり、物品の価格を精査し、安価なものまたはキャンペーン中のものの購入に努めたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後の研究の推進方策に従い、物品費で当該物品を購入し、適せん使用、研究の推進に努める。また、旅費・その他に関しては、成果発表、資料収集、研究打ち合わせ等に使用し、本研究成果を発信し、研究を円滑に遂行する。
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