2015 Fiscal Year Research-status Report
配置を精密に制御した高分子量ヘモグロビン集合体（人工酸素運搬体）の創製
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26750149
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
松平 崇 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (20570998)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 血液代替物 / 高分子 / ヘモグロビン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、輸血用赤血球の代替となり得る人工酸素運搬体として、ヘモグロビン（Hb）の配置を精密に制御した高分子量Hb集合体（aligned megadalton Hb; AM-Hb）の創製を目的としている。本研究では、合成方法の探索、物性測定、動物投与試験という三段階のステップにより、合成したAM-Hbの人工酸素運搬体としての性能を評価し、得られた結果を分子設計に反映して分子構造を最適化していく。平成２６年度までに、末端に官能基が導入されたPEG誘導体を過剰のHbと反応させることで、分子量が精密に制御された１種類のAM-Hbを合成、精製する方法を確立した。
平成２７年度では、分子設計に立ち返り、架橋剤として用いるPEG誘導体を変更することで、数種類のAM-Hbを得ることに成功した。合成されたAM-Hbを電気泳動法とサイズ排除カラムクロマトグラフ法で分析したところ、架橋剤の鎖長によりAM-Hbの分子サイズを任意に制御できる可能性が示された。
また、平成２６年度に合成されたAM-Hbでは、精製、濃縮後の濃度がHb換算で2 g/Lと低く、人工酸素運搬体として要求される濃度（7 g/dL以上）を達成していないことが問題であったが、平成２７年度では、異なる濃縮手法を適用することで、濃度を7.3 g/dLまで増大させることに成功した。
一方、平成２６年度に合成されたAM-Hbを月単位で長期保存する過程において、メト化や変性に起因するHbの質の劣化が観測された。また、AM-Hbを動物投与試験に使用するために、合成過程における菌の混入を防ぐ方法、あるいは合成後に滅菌する方法を確立する必要が生じた。これら、AM-Hbの保存方法と滅菌方法の確立は、申請時には予期しなかった課題であり、動物投与試験を行うために解決する必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２６年度の研究成果報告書にて設定した、平成２７年度以降の研究推進方策の内容に則って、進捗状況を報告する。研究の推進方策に従い、まずは合成、精製されたAM-Hbについて、物理化学的性質を調べ、目的に即した性質となるように分子設計や合成方法の改良を行った。平成２７年度に分析されたAM-HbのHb濃度、粘度、分子量測定を行い、特に濃度において、要求される7 g/dLという基準値を達成可能な合成、精製、濃縮方法を確立した。また、分子量測定の結果を分子設計にフィードバックして、異なる架橋剤を用いたAM-Hbの合成を行い、架橋剤とAM-Hbの分子サイズとの関係性について知見を得た。これらの結果から、AM-Hbの分子設計と合成法の最適化については、設定した研究推進方策通り順調に研究が進行していると評価できる。
また、平成２６年度の研究成果報告書では、合成されたAM-Hbについて動物投与試験により一般毒性試験や血中半減期の測定を行い、毒性の有無を調べ、肝臓や腎臓などの機能へ与える影響を追跡することを計画した。この研究推進方策に従い、平成２７年度ではAM-Hbを用いた動物投与試験の実施を目指した。動物投与試験の実施に際しては、実績の項にて報告したHb品質の低下が問題となる。また、合成、精製、濃縮に用いた試薬や器具は、濃縮Hb以外はすべて滅菌されていないものを用いているため、混入した雑菌が実験動物に与える影響が大きな問題になる。そこで平成２７年度は、合成したAM-Hbを滅菌する方法の模索と、合成経路すべてを滅菌条件下で行う方法の検討という２種類のアプローチによりこの問題の解決を図った。動物投与試験の実施については設定した研究推進方策に従って実験準備を行っている段階であると評価できる。
以上の結果から、動物投与試験の実施には至っていないものの、研究は概ね順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２６年度、２７年度から引き続き、合成、精製されたAM-Hbについて、人工酸素運搬体としての物性化学的な評価からフィードバックして分子設計、合成方法を最適化する。要求される物性は7 g/dL以上のHb濃度、血液に近い粘度（3～4 cP）、20～25 torr以下の膠質浸透圧、そして約50 nm以上の粒子径であるが、加えて、動物投与試験を行うためにAM-Hbを劣化無く保存する方法、及び動物投与試験の実施を阻害する雑菌の混入防止あるいは除去の方法を確立する。
上記の目標が達成されたAM-Hbを実験動物（ラット）に投与し、一般毒性試験や血中半減期の測定などを行い、毒性の有無を調べる。また、継続投与が肝臓や腎臓などの機能へ与える影響を追跡する。毒性が発現した場合には原因を究明し、分子設計に立ち戻ってAM-Hbの化学構造を最適化する。
動物投与試験において良好な結果が得られた場合、AM-Hbを数十～数百mL単位の大スケールで合成する方法を確立する。実用化を視野に入れ、菌の混入を防止しつつ未反応の原料などの不純物をより簡便に取り除く方法や、高い収率、より安価な原料や反応試薬を用いることによるコスト低下を検討する。また、大量に合成されたAM-Hbをラットの循環血液量の90%以上を交換し、大量投与時の安全性を調べる（血液希釈実験）。さらに、出血性ショック状態にあるラットにAM-Hbを大量に投与し、赤血球を投与した場合と同等に回復するか調べる。医療の現場で実際に輸血が必要な場面と同じ環境で有用性を確認することで、合成したAM-Hbが赤血球に替わる人工酸素運搬体としての使用が可能か評価する。
さらに、得られた成果をとりまとめ、学会、論文という形で対外的に発表する。
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| Causes of Carryover |
交付申請書において、平成２７年度には、動物実験によって一般毒性試験や血中半減期の測定などを行い、毒性の有無を調べるために、実験動物（ラット）の購入を消耗品費として計上していた。また、動物実験の血液サンプルの生化学検査を専門業者に委託分析する予定であった。しかしながら、動物実験の前段階においてAM-Hbの品質劣化と雑菌混入が問題となり、動物実験に至らなかった。このため、動物実験に使用する予定の資金が余剰資金として発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
＜設備備品費について＞ 大量に合成したAM-Hbを精製、濃縮するために、ステンレス製90 mmフィルターホルダー（ミリポア製、型番：SUS316）（\161,000）を購入する。
＜消耗品について＞ 試薬類のうち主なものとして、原料として用いるPEG誘導体300,000/3 g、HPLC及び電気泳動用分子量マーカー\52,000/年等が挙げられる。加えて、平成２８年度は動物実験を行うためにラット（50匹\100,000/年）を購入する。器具類は、合成を行うために必要なガラス器具、精製用の限外ろ過膜、動物実験の飼料などを含む。
＜旅費、謝金等について＞ 研究成果発表のため、学会発表の旅費と論文投稿の費用を計上している。また、平成２８年度は、動物実験において必要な血液生化学検査を専門業者に委託して行う。
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