2015 Fiscal Year Annual Research Report
味覚受容体の生化学的解析および機能抗体作製に向けた基盤技術の開発
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26750365
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (40609393)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 味覚受容体 / 膜タンパク質 / モノクローナル抗体 / リポソーム / 相互作用 / コムギ無細胞系 / GPCR / 脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
味覚受容体の細胞外ループに結合する抗体を効率的に取得するため、味覚受容体３種の膜貫通ドメインと細胞外ループをタンデムに連結した人工膜タンパク質のデザインを試みた。設計した人工膜タンパク質をコードした人工遺伝子を無細胞発現ベクターに組み込んだ。無細胞合成した人工膜タンパク質をウサギに免疫し、ISAAC法で抗体遺伝子の取得を試みた。しかし、残念ながら甘味受容体に特異的な抗体は取得できなかった。その代わり、コントロールのMockリポソーム（mRNAを加えていない膜タンパク質合成反応液）に反応するウサギモノクローナル抗体を８種取得した。
Mockリポソームに結合する抗体の性状解析を進めた。これらの抗体は小麦胚芽抽出液には反応せず、ビオチン化アゾレクチンリポソームと強く結合した。さらに、PA, PC, PE, PG, PI, PSなどの脂質単独で形成したリポソームと反応させたところ、１種の抗体を除き、単独脂質からなるリポソームとは反応しなかった。単独脂質と反応した抗体をさらに多種の脂質と反応させたところ、リゾPC, リゾPEなどのリゾリン脂質と強く結合していた。
取得したアゾレクチン抗体を用いて、リポソーム間の相互作用検出系の構築を試みた。アゾレクチンからなるリポソームと、ホスファチジルコリンにビオチン化脂質を添加したビオチン化PCリポソームをそれぞれ調製し、相互作用することが知られている可溶化タンパク質を融合した膜タンパク質２種をそれぞれのリポソーム上に合成した。ビオチン化PCリポソームをストレプトアビジンビーズで、アゾレクチンリポソームを抗アゾレクチン抗体ビーズでラベルし、両ビーズの近接をAlphaScreenで検出したところ、リポソーム間の相互作用を示唆するデータが得られた。
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| Remarks |
GPCRに対する抗体作製技術を発表した成果がScientific Reports誌に掲載されたことをプレスリリースで発表し、愛媛新聞（2015年6月22日朝刊）、日経新聞（2015年7月6日全国版朝刊）、科学新聞（2015年6月19日）にそれぞれ掲載された。
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[Journal Article] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay2015
Author(s)
1) Takeda H, Ogasawara T, Ozawa T, Muraguchi A, Jih PJ, Morishita R, Uchigashima M, Watanabe M, Fujimoto T, Iwasaki T, Endo Y, Sawasaki T
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Journal Title
Sci Rep
Volume: 5
Pages: 11333
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Claudin-1 Binder Enhances Epidermal Permeability in a Human Keratinocyte Model2015
Author(s)
Nakajima M, Nagase S, Iida M, Takeda S, Yamashita M, Watari A, Shirasago Y, Fukasawa M, Takeda H, Sawasaki T, Yagi K, Kondoh M
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Journal Title
J Pharmacol Exp Ther
Volume: 354
Pages: 440-447
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay.2015
Author(s)
Takeda H, Ogasawara T, Ozawa T, Muraguchi A, Jih PJ, Morishita R, Uchigashima M, Watanabe M, Fujimoto T, Iwasaki T, Endo Y, Sawasaki T.
Organizer
GPCR work shop
Place of Presentation
Kona, Big island Hawaii, Hi, USA
Year and Date
2015-12-01 – 2015-12-05
Int'l Joint Research
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[Presentation] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay2015
Author(s)
2) Takeda H, Ogasawara T, Ozawa T, Muraguchi A, Jih PJ, Morishita R, Uchigashima M, Watanabe M, Fujimoto T, Iwasaki T, Endo Y, Sawasaki T
Organizer
Protein Island Matsuyama international symposium
Place of Presentation
松山市男女共同参画推進センター（愛媛県・松山市）
Year and Date
2015-09-25
Int'l Joint Research
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