2014 Fiscal Year Research-status Report
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26750369
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上野 匡 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (60462660)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / アクチン繊維 / 構造活性相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アクチンは細胞骨格の一種であり，様々な外的な刺激や発生のコンテクストに応答して，ネットワークが速やかに再編成され，これにより細胞極性形成や神経突起の伸長，細胞運動などの細胞のダイナミクスが支えられている．本研究課題では，運動や細胞内物質輸送等のさまざまな現象で多種多様な機能を果たすアクチンの動的挙動を可視化可能な合成小分子の蛍光プローブを開発することを目的に，独自の発見に基づきプローブの開発を行っている．
申請者は，本研究課題とは別の目的の蛍光プローブの開発を行う過程で得られたプローブの合成中間体がアクチン繊維を染めることを偶発的に発見しており，これが本研究課題の端緒となった．従来，アクチン繊維に高い親和性を有する化合物は，複雑な構造を有する非天然環状ペプチドや大員環ラクトンが報告されるのみであったが，申請者らの発券した分子はロドール類に属する非常に単純な蛍光分子でありながら，アクチンへの高い結合性を呈することが種々検討により明かになった．続いて，蛍光分子とアクチン繊維への結合性と構造活性相関を明らかにすべく，得られているアクチン結合性の蛍光色素の類縁体を系統的に設計し，有機化学的に合成を行った．具体的には，ロドール骨格の9位の芳香環，N の置換基，ロドール骨格からローダミン骨格への変更を行った化合物を合成し， in vitro におけるアクチン繊維再構成系や細胞に合成したプローブ群を適用することで，アクチン結合能に関する影響に関して精査した．これにより，現在得られているロドールを母核とする分子全体がアクチン繊維に認識されているのではなく，分子量300程度の比較的小さな化合物も特定の部分構造を有していればアクチン繊維への親和性を呈することが明かとなった．このような小分子はこれまでに例がなく，非常に興味深い発見である．現在，繊維への結合様式に関して精査を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題申請時においては，アクチン繊維を可視化可能な蛍光プローブの開発を行うことを目的とし，研究を遂行しており，26年度中は母核となっているロドール類の類縁体を系統的に合成し，構造活性相関を明らかにすることを計画していた．
26年度中，申請者は，当初の計画通り，ロドール類の類縁体の設計・合成を行い，これを速やか達成しており，更に，蛍光母核をローダミン等へ変更した化合物などを系統立てて合成，アクチン繊維への結合性の精査を行った．従来報告されているアクチン繊維に親和性を有する化合物は，ファロイジンなどの天然物由来の非天然アミノ酸を有する環状ペプチドであることから，我々が発見したロドール誘導体に関しても，分子全体が繊維に認識されている可能性も考えられた．一方で，系統的に合成した蛍光プローブ群とアクチン繊維の結合能の精査においては，端緒として得られていた化合物を誘導体化しても，親和性に変化がみられるものの，ある程度官能基を変換しても親和性が失われることなく，また母各自体の環を縮小するなど大胆に構造展開した場合においても，予想に反して親和性は失われない，という結果が得られている．このような発見は当初予期していなかった結果でもあり，今後，プローブ開発を行う上で重要な知見となると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題は，プローブの系統的な合成 In vitro における活性の精査や，生細胞，固定細胞を用いた系において体系的なデータをスムースに得られる実験系の構築も進んでおり，ここまで順調に進行している．今後は26年度に開発したプローブとアクチン繊維の結合様式の精査のため，ドッキングシミュレーションなどの手法も取り入れていく予定である．また，アクチンは低次の細胞から動物まで，アミノ酸レベルで高度に保存された蛋白質ではあるため，多様な種の細胞から得られるアクチン繊維への結合能を比較精査できれば，化合物のアクチン繊維への結合様式を解明する糸口となることが期待できる．
本研究課題の最大の目標は，生細胞におけるアクチン再構成系の可視化に応用可能なプローブの開発にあるので，合成した化合物がアクチン繊維に作用した場合に，繊維の伸張や崩壊にたいしてどのような影響があるかを定量的に見積もる実験を今後，行っていきたいと考えている．これまでの予備実験結果では，In vitro においてはアクチン繊維伸張反応が高濃度のプローブ曝露によって弱く阻害されるという知見が得られており，これがプローブの繊維への結合様式による影響なのか，単量体アクチンへの結合の結果なのか，もしくは有機小分子が大量に存在する影響なのかを明らかにすべく，今後，慎重に精査を重ねていくことが必要であると考えている．生細胞内におけるアクチン繊維の再構成系では，in vitro 試験では用いていないアクチン結合性タンパク質の働きによってアクチン繊維の量や質が決定づけられていることから，アクチン結合性たんぱく質への影響の有無も含めて精査していく必要があると考えている．
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| Causes of Carryover |
当初の計画では，蛍光色素のアクチン繊維結合を精査すべく，ファロイジン染色と開発する化合物の共染色における蛍光の像面のズレが最大限に補正されていることが重要であると考え，軸上色収差を含めた諸収差が高度に補正されている６０倍油浸 対物レンズ ・UPlanSApo 60xO (Olympus 社製，1 x 250千円相当）を初年度に購入する計画であった．実際，蛍光顕微鏡上で実験を行ったところ，ファロイジン染色に用いる色素の波長を限定すれば，軸上色収差は大きな問題としてはあらわれないことが判明し，当該レンズの購入を見送った結果，繰越金が発生した．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度においてはプローブの合成を主に行ったが，27年度は，in vitro における生化学実験による精査や生細胞イメージングによる精査を順次行っていく予定である．このため，26年度からの繰越金を，これらの実験に必要なプラスチック消耗品や実験試薬・サンプルの購入費に充てる予定である．
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Research Products
(1 results)
