2014 Fiscal Year Research-status Report
合成分子プローブを基盤としたテーラーメイドアデニレーションドメインの創出
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26750370
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
石川 文洋 京都大学, 生理化学研究ユニット, 助教 (50631553)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 非リボソーム性ペプチド合成酵素 / 非リボソーム性ペプチド / アデニレーションドメイン / 合成分子プローブ / ELISA / 酵素機能改変 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
非リボソーム性ペプチド合成酵素 (NRPS) のアデニレーション (A)に対する高親和性プローブ (aminoacyl-AMS-biotin)の設計および合成を行った. プローブの設計は, Aドメインの触媒反応における高反応性中間体であるアミノアシル-AMPのリン酸エステル結合を安定なsulfamoyl基で置換することに基づく. プローブ分子の固相担体への固定化およびストレプトアビジンとNRPSモジュールとの立体的な反発を最小限にする目的で56Åのスペーサーを有するPEG12-biotinをアデノシンの2’位に導入した. Phe, Pro, Tyr, 2,3-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB)およびサリシル酸 (Sal)をリガンド部に有する高親和性プローブを確立した合成経路を基盤とし共通中間体から4工程で合成を行った.これらプローブ分子は,NRPSのAドメインに対し非常に強い親和性を有することが明らかとなった (10-200 nM). テーラーメイドなAドメインの創出に向けて, 設計した基質特異性を有するAドメインをスクリーニングするシステムを構築することは重要な課題である. そこで, 迅速, 簡便, 高感度なELISA platformの開発を検討した.プローブ分子 (Phe-AMS-biotin)のビオチン官能基を利用し, streptavidin-coated plateにプローブを固定化した. 次に, NRPSと結合反応を行った. 続いて一次抗体として抗His抗体を, 二次抗体としてHRPを縮合した抗マウス抗体を用いることで, Pheに基質特異性を有するAドメインを有するNRPS (GrsA)の特異的検出に成功した.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究は, 当初の研究計画通り,Aドメインに対する高親和性AMS-biotinプローブの設計・合成に費やされた. また, 各プローブ分子のAドメインに対する阻害定数Ki値の算出, さらに, 各プローブ分子を固定化したAドメインに対するELISA法の構築を行うことができた. 上記3点を総合し, 本年度の研究は, おおむね順調な進展をみせたと言うことができる.
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降も, 引き続きNRPSのAドメインに対するELISA法の構築を行っていく予定である. とりわけ次年度は当初の研究計画に従い, Aドメインライブラリーの構築, 設計した基質特異性を有するAドメインのスクリーニングシステムの構築を行っていく.
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[Presentation] Chemical Biology for modulators targeting cancer microenvironment and cell membrane signaling.2015
Author(s)
Kakeya, H., Yoshimura, A., Sugiyama, R., Kishimoto, S., Nishimura, S., Hattori, A., Ishikawa, F., Yomoda, Y., Lu, S., Katagiri, N., Shimada, S., Seto, E., Hayashi, H., Takahashi, N., Harada, H.
Organizer
Natural Products 2015; Natural product discovery & development in the post genomic era
Place of Presentation
San Diego
Year and Date
2015-01-11
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