2014 Fiscal Year Research-status Report
ヒストン脱アセチル化酵素活性を検出するプローブの開発
| Project/Area Number |
26750371
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
蓑島 維文 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 特任助教 (20600844)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 化学プローブ / エピゲノム創薬 / ヒストン脱アセチル化酵素 / DNA |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の活性を簡便・安定に蛍光検出する手法の開発に取り組む。HDAC はタンパク質の脱アセチル化を行い、核内におけるクロマチンの構造変化や転写の抑制に関連している。加えてがんや精神疾患の発症に関わる重要な機能を持った酵素であり、標的とした薬剤が盛んに開発されていることから、その活性の簡便迅速な検出手法が強く求められている。しかしながら既存の手法では抗体や他の酵素を用いる複数の操作が必要なことから、迅速な検出、酵素反応のリアルタイムな追跡ができないという問題点があった。
そこで本研究ではHDACがヒストンとDNAの相互作用に影響することに着目し、蛍光プローブとDNAを使ったHDAC活性検出法を新たに開発する。蛍光プローブの設計としては、DNAに結合する際に蛍光を発する核染色色素部分と、HDACが反応するアセチルリジンを含む基質部分を連結させる。HDACにより脱アセチル化反応が起こることでプローブの基質部分がリジンへと変換され、正電荷を持つことで負電荷を有するDNAに結合するようになり蛍光が増大するものと予想した。すなわち、HDACの活性をプローブのDNA 結合能の変化として検出することを考えた。
設計したプローブの合成法を色素部分の有機合成ならびにペプチド固相合成の手法を用いて確立する。合成したプローブを用いてDNA 存在下でヒト由来の種々のHDAC との酵素反応を行い、その検出を試みる。基質部分の構造によるHDAC活性検出への影響を蛍光測定により定量的に評価する。これらの評価結果を基にして、核染色色素部分、基質部分および両者をつなぐリンカーにおいて検討を進めることでプローブ分子構造の最適化を行う。加えて、単離酵素及び培養細胞を対象としたHDAC阻害剤のスクリーニング手法を開発へと応用する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HDAC検出用蛍光プローブとして、DNA結合色素（チアゾールオレンジ誘導体）を、アルキル鎖のリンカーで基質部分と連結させたプローブを設計した。プローブの合成において、基質部分であるペプチド配列をFmoc固相法によって伸長し、有機合成によって供給された色素部位を固相上で連結させて目的のプローブを合成することができた。条件検討を重ねることで、固相からの切り出し後、プローブを純度良く容易に得る手法を確立した。
この手法を用いて最初に基質部分としてアセチルリジン、及びHDACによる脱アセチル化反応が起こった際に生成するリジンを含むプローブをそれぞれ合成した。安価に入手可能な子ウシ胸腺DNAと混合して蛍光強度を測定したところ、アセチルリジンに比べてリジンを基質として有するプローブの方で有意に蛍光が増大していることを観察した。また、アルキル鎖のリンカーの長さを調節することで、脱アセチル化による蛍光シグナルの差が大きく見られ、分子構造がDNA結合に影響していることを見出した。加えて、基質部分の検討を行ったところ、単にアセチルリジンのみを基質にするより、隣接する残基にアミノ酸を導入することでHDACとの反応性が大きく向上することを見出した。これらの結果を基にプローブ分子構造を最適化した。
このプローブを使い、DNA存在下、HDACの一種であるSIRT1と反応させたところ、反応時間依存的に蛍光が上昇することを観察した。HPLC分析の結果から脱アセチル体の生成が蛍光の上昇と一致しており、本検出法がHDAC酵素反応をリアルタイムに追跡できることを示した。さらにこの知見を利用して、HDAC酵素反応の速度解析を行った。また、阻害剤を用いた検出を行い、本手法がHDAC阻害剤の評価にも応用できることを示した。以上の成果を論文としてまとめ、発表した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
前年度ではHDAC活性を検出できる蛍光プローブの分子設計・合成を行い、DNA存在下でHDACの一種であるSIRT1の活性検出を達成した。しかしながら実際にHDACは4つのクラス、18種類に区分され、おのおのの酵素が異なる役割を持っていることが知られている。そこで、本研究で開発したプローブがSIRT1以外のHDACの検出にも適用できるかどうかを調べるため、まずは各HDACとの反応後の蛍光シグナルの変化を測定することと、酵素反応の進行の分析を行う。次にプローブの基質部分に当たるペプチド配列と長さの検討を進める。配列は天然の基質であるヒストンH4などを参考にし、アセチルリジンの周辺の配列を基質として導入したプローブを設計し、既に確立した固相合成法によって合成する。これらの合成したプローブを用い、各HDACに対する蛍光応答性、ならびに反応性を蛍光測定ならびにHPLC分析を使って評価・比較していく。得られた結果よりそれぞれのHDACにおける最適な基質を選択する。
また、細胞内でのHDAC活性検出ができるかを評価していく。培養細胞中からHDACが含まれると考えられる核内に存在するタンパク質を抽出し、得られた抽出液をプローブと混合して反応を行い、蛍光検出が可能かどうかを評価していく。また、生細胞での評価が可能であるかを調べるため、プローブ添加後の細胞を蛍光顕微鏡で観察する。
|
| Causes of Carryover |
当初購入を予定していた備品を研究の遂行状況により購入を見送ったため、物品費の執行が少なくなった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費は予定通り使用していく予定である。次年度使用額の部分は、12月に参加予定の国際学会の参加費・旅費に充てる予定である。
|
