2015 Fiscal Year Research-status Report
リン酸化シグナリング解析手法の確立とシグナル研究への展開
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26750372
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
杉山 康憲 香川大学, 農学部, 助教 (10632599)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | リン酸化シグナリング / プロテインキナーゼ / マルチPK抗体 / Phos-tag SDS-PAGE / 抗がん剤 / リン酸化プロテオーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内情報伝達において重要な役割を果たすプロテインキナーゼは、タンパク質のリン酸化を介してその機能を制御することにより、多様な生命現象に関与している。哺乳動物のプロテインキナーゼは５００種類以上報告されており、状況に応じてその発現量、活性、細胞内局在などが制御されている。従って、細胞内プロテインキナーゼの全体像を解析することができれば、様々な生命現象や疾病の原因解明において重要な意味を持つ。
このような背景の中、我々はプロテインキナーゼを幅広く認識できるモノクローナル抗体としてマルチＰＫ抗体を作製した。この抗体を用いることで細胞内プロテインキナーゼの発現量をプロファイルすることが可能である。これらの多くのプロテインキナーゼの活性は上流のキナーゼや自身によるリン酸化によって制御されることが知られている。そこで、リン酸化タンパク質をシフトアップバンドとして検出できるPhos-tag SDS-PAGEとマルチPK抗体を組み合わすことにより、プロテインキナーゼの発現量とそのリン酸化状態（活性化状態）をプロファイルする手法を開発した(sugiyama et al., MethodsX 2, 469-474, 2015)。
ヒト前骨髄性白血病細胞に様々なキナーゼを標的とする抗がん剤を３日間処理し、細胞内プロテインキナーゼを前述の方法で解析したところ、多数のキナーゼの発現量が変化するだけでなく、そのリン酸化状態が顕著に変動することを明らかとした。このうち、Vandetanibという抗がん剤を処理し、最も顕著にリン酸化状態が変動していたキナーゼがSykであることを見出した。これらのことから、本手法は、マルチ標的型の抗がん剤の主標的を見出せるだけでなく、細胞内プロテインキナーゼの動態を解析する上で非常に有効な手法であることが示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の基盤となる、マルチPK抗体とPhos-tag SDS-PAGEを組み合わせた細胞内プロテインキナーゼの動態解析法を確立し、2015年に学術雑誌MethodsXにて報告した。加えて、本手法を用いた、抗がん剤の標的解析についても併せて報告した。そのため、本研究課題はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回報告した手法では一次元の電気泳動を活用した方法を報告している。しかしながら、一次元の電気泳動では多数のバンドのリン酸化シフトを同時に検出してしまうため、どのバンドがシフトアップしているか判断がつかないという問題点が生じる。そのため、一次元目に等電点分離を行う手法を用いた二次元電気泳動法を用いた解析を進めることで、この問題の解決できると考えた。そのため、今後は本手法の発展型として二次元電気泳動を用いた解析法を開発していく。
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| Causes of Carryover |
旅費として申請していた予算が、学会先の関係で出費が抑えられたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に必要である細胞培養関連試薬や生化学実験試薬などの物品費に計上する。
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[Journal Article] Overexpression of NF90-NF45 represses myogenic microRNA biogenesis, developing skeletal muscle atrophy and centronuclear muscle fibers2015
Author(s)
Hiroshi Todaka, Takuma Higuchi, Ken-ichi Yagyu, Yasunori Sugiyama, Fumika Yamaguchi, Keiko Morisawa, Masafumi Ono, Atsuki Fukushima, Masayuki Tsuda, Taketoshi Taniguchi, Shuji Sakamoto
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Journal Title
Molecular and Cellular Biology
Volume: 35
Pages: 2295-2308
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Expression and phosphorylation state analysis of intracellular protein kinases using Multi-PK antibody and Phos-tag SDS-PAGE2015
Author(s)
Yasunori Sugiyama, Syouichi Katayama, Isamu Kameshita, Keiko Morisawa, Takuma Higuchi, Hiroshi Todaka, Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, Tohru Koike, Taketoshi Taniguchi, Shuji Sakamoto
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Journal Title
MethodsX
Volume: 2
Pages: 469-474
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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