新規光シート顕微鏡を用いた真核細胞内の１分子蛍光イメージング手法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26790027
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 西村 和哉 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 客員研究員 (50643186)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 光シート顕微鏡 / １分子計測

Outline of Annual Research Achievements

1分子蛍光イメージングはタンパク質を直接観察することで、タンパク質の局在、相互作用が直感的かつ定量的な知見を我々に与えてくれる。しかしながら、計測可能な細胞、タンパク質の種類には限りがある。本研究では、真核細胞の細胞内に存在するタンパク質を１分子レベルでの計測できる系を開発する。
平成２６年度では、真核細胞のモデル生物である出芽酵母内を用いてタンパク質１分子レベルで発現量を計測する系を構築した。平成２６年では酵母の１分子計測を酵母の細胞膜に局在化させることで高いシグナルを得ることができてきた。それに対して平成２７年度では局在化しない状態での１分子観察を試みた。局在化しない状態では露光時間を長くすることができないため、励起光の強度を高くする施策をとった。しかしながら、シグナルとともに細胞内の自家蛍光もともに増加し観察は困難であった。自家蛍光を抑制するために、紫外光を与えると吸収波長と蛍光波長が変化する光変換型蛍光タンパク質の特性を利用した。波長変化させる前には、観察時に使う励起波長をでは励起されず退色しないので、あらかじめ細胞に自家蛍光成分を退色させてから、紫外光を照射し観察を行った。この方法を取ることで、細胞内にある１分子がブラウン運動している様子が計測することができた。
また、培養細胞であるHeLa細胞内でも光変換型蛍光タンパク質を用いることで１分子計測が可能であった。平成２７年度では、出芽酵母および培養細胞内を自由に拡散しているタンパク質について１分子観察を行うことができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では厚みのある細胞において、１分子計測できる顕微鏡を開発して、真核細胞内を拡散しているタンパク質分子を定量化することを目標としている。平成２７年度までに出芽酵母内において、細胞の字自家蛍光を回避する施策、局在化したタンパク質および光変換型蛍光タンパク質を行うことで、細胞内の蛍光タンパク質を１分子レベルで観察することができた。研究計画当初から細胞が持つ自家蛍光が観察を妨げることは想定しており、研究計画書通りに施策を講じることにより１分子観察が真核細胞内で計測可能することができたのが評価に値する。

Strategy for Future Research Activity

平成２７年度までに、細胞内にあるタンパク質１分子レベルでの計測の測定方法について基礎検討ができている。今後の課題としては、研究行った１分子レベルの計測方法についての方法について学術論文にまとめていく。またタンパク質１分子を観察の有用性を示すためアプリケーションの開発を行う。

Causes of Carryover

研究計画がおおむね順調に進んでおり、研究部材の投資が少なくて済んだため経費に余剰が生じた。また、学会発表への旅費を計上していたが、研究の機密性を保つため参加しなたので計上した旅費が余剰となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

計画通り研究試薬・光学部品の購入を行う。旅費は予定している学会参加費にあて、その他については論文の英文構成費にあてる。