2014 Fiscal Year Research-status Report
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26810090
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
仲野 瞬 京都大学, エネルギー理工学研究所, 助教 (40650809)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 人工酵素 / RNA-ペプチド複合体 / in vitro セレクション / リン酸化反応 / リセプター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. RNA-ペプチド複合ライブラリーの設計と作製
本研究では、ランダム化された配列を持つRNAサブユニットとそれをコードして合成されるランダム配列をもつペプチドサブユニット同士が共有結合で連結され、かつ固定配列の領域同士で複合体を形成する「RNA-ペプチド複合ライブラリー」を、mRNAディスプレイ法を応用して作製し人工酵素の獲得を目指す。RNA-ペプチド複合体(RNP)形成部分として、RRE RNA- Revペプチド複合体を用いる。固定配列であるRRERNAがRevペプチドの一部をコードするように変異導入したライブラリーを設計、合成した。この変異導入RRE RNA配列とRevペプチドとの複合体形成が確認できた。現在、RNA-ペプチド複合ライブラリーの合成条件を検討中である。
2. ATPのリン酸基特異的な識別が可能なRNPリセプターの作製
ペプチドリン酸化酵素の作製において、リン酸基の認識能は重要である。これまでに作製されたATPをはじめとするヌクレオチドに結合するアプタマーでリン酸基を認識、識別可能なものは事例に乏しく、RNAのみでリン酸基を識別可能なリセプターを作製するためにはセレクションの選択圧の制御が必要であると考えられる。実際にRNAのみをランダム化したRNPライブラリーを用いてATPのリン酸基の識別が可能なRNPリセプターの作製を試みた結果、リン酸基識別能は有するものの、基質親和性が低いリセプターが獲得された。これは、リン酸基の識別能と親和性とを両立したリセプターをRNAのみのライブラリーから獲得するための分子選択条件の確立の難しさを示している。RNA-ペプチド複合ライブラリーを使用したセレクションによってこの傾向がどのように変化するか、また、触媒活性をもつ分子を獲得するために、ペプチドライブラリーがどのような役割を果たすかを考察する上でもこの知見は有用である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、本研究で用いるRNA-ペプチド複合ライブラリーの設計と作製条件を検討した。RNAサブユニット配列がペプチドサブユニット配列をコードし、かつ固定の配列領域においてRNAおよびペプチドサブユニットが複合体を形成するRNPライブラリーを設計した。ランダム領域以外の部分が最小の分子サイズを持つように変異導入を行ったRRE RNAにおいてもRevペプチドと複合体を形成できることを、蛍光性RNPセンサーの機能評価によって確認した。この知見をもとにmRNAディスプレイ法を適用するためのライブラリーの設計を行った。現在、高収率なRNA-ペプチド複合ライブラリー合成条件を検討している。当初、RNA配列の変異により複合体形成能が喪失し、ライブラリー設計の抜本的な変更が必要となる可能性もあったが、この検討結果により比較的円滑に次段階に着手できた。
これに並行して、「RNAのみがランダム化された」RNPライブラリーを利用してリン酸基の識別能を有するリセプターの作製を行った。従来使用してきたこのライブラリーから作製する分子とRNA―ペプチド複合ライブラリーから作製する分子の差異を比較することで、本手法の特徴および有用性を検討することができると考えられる。「リン酸基部分を識別できるATP結合性RNPリセプター」を作製した結果、リン酸基識別能は有するものの基質親和性が従来のRNPリセプターと比べて低いリセプターが得られた。この知見は今後RNP-ペプチド複合ライブラリーを用いて作製するリセプターや人工酵素の機能との比較に有用である。また分子選択圧と作製される分子の機能との相関に関する情報は、今後のセレクションの条件を決定する上で有用である。
このように、RNA-ペプチド複合ライブラリーを用いたセレクションの実施に対する基本条件の検討を着実に行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はRNA-ペプチド複合ライブラリーの合成条件を最適化しつつ、作製したライブラリーを用いて実際にペプチドリン酸化活性を指標とした人工酵素のセレクション、リン酸基を特異的に識別するリセプターの作製を目指す。当初の計画通り、リン酸基に特異的に結合するPhos-tagを利用して、基質ペプチド部位にリン酸化が行われたRNPを選択する。高い触媒活性を有するRNPの獲得が可能な条件を選択圧を変更しながら、検討していく。得られたRNPのRNAおよびペプチド配列を解析し、その特徴を明らかにする。
獲得したRNP分子を用いて、実際にペプチド、および同一配列を有するタンパク質を基質としたリン酸化反応が進行するかどうかを確認する。触媒活性のある分子いついて、基質の配列特異性や反応に最適な条件の検討をキネティクスの解析を行いながら検討していく。
触媒活性を有する分子の獲得が困難な場合は、ライブラリーサイズの変更や基質ペプチド配列の変更、分子選択条件の変更を行い、獲得を目指す。
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| Causes of Carryover |
ライブラリー作製条件の検討をはじめとする基礎条件検討の結果が良好であり、比較的順調に研究を進めることができ、当初計画していた消耗品の消費量よりも比較的余裕をもって、実験遂行ができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究の次段階であるセレクションでは、酵素活性を有する分子の獲得に多様な条件を適用し分子の作製が可能かどうかを比較、検討することが求められると予想される。試薬、消耗品の消費量も増加すると予測されることから、主に酵素類やペプチド合成試薬、チップ等の消耗品購入費に充当する計画である。
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