デジタルPCRを用いた水中ノロウイルスの遺伝子型別定量手法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26820222
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 端 昭彦 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 研究員 (70726306)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 水環境 / ノロウイルス / リアルタイムPCR / 次世代シーケンシング / デジタルPCR

Outline of Annual Research Achievements

本年度は，デジタルPCRによるノロウイルス検出用のTaqManプローブ設計のため，主に環境中のノロウイルス遺伝子配列解読に取り組んだ．水環境中のノロウイルスの流行状況を把握するため，京都府内の河川4地点で試料を収集・分析した．試料収集は1年間，ほぼ月に1度の頻度で行い，4地点から計52試料を得た．試料は1 Lを陰電荷MF膜による吸着・誘出法及び遠心式UF膜を用いた手法により0.7 mLまで減容した．減容した試料はRNA抽出操作に供し，ノロウイルス遺伝子解析に供した．収集試料はRT-qPCRによるGI-及びGII-ノロウイルス (NoV) の検出に供した．GI-，GII-NoV陽性であった試料のうち，検出濃度の特に高かった24試料について，RT-nested-PCRによるNoV遺伝子増幅を試み，得られたPCR産物をillumina Miseqによる次世代シーケンシングに供した．シーケンシング解析の結果，2015－2016年シーズンに流行を引き起こしたGII.17型や，2015年以前に流行していたGII.4型をはじめ，GI.1，GI.2，GI.4，GI.5，GI．６，GII.3型，GII.6型といった，多様な遺伝子型に由来する配列が得られた．これらのうち，流行型であるGII.17型及び，収集試料より高頻度で検出されたGII.3型に由来するPCR産物をクローニング操作に供し，プラスミドDNAを得た．また，データベースより，GII.1－GII.21型それぞれの遺伝子配列を収集した.今後は，これらデータベース上の配列及びプラスミドDNAの配列を基に，GII.3型及びGII.17型それぞれに特異的なTaqManプローブを設計し，デジタルPCRによる特異的な検出系を構築していく予定である．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請段階では，本年度は環境試料の収集・分析及びデジタルPCRによるノロウイルス検出系の検討を行う予定であった．環境試料の収集・分析については，当初の予定通り通年で試料を収集し，ノロウイルスの存在状況調査及び遺伝子配列の解析を進めることができた．また，遺伝子配列解析にあたり，次世代シーケンシングを用いることで，想定していたよりも多様なノロウイルス遺伝子配列を解読，分析することができた．ウイルス検出系の検討については，環境試料に由来する配列及びデータベース上の配列の収集，整理を行い，検出系設計に必要な情報を揃えた．しかしながら，研究室内において，デジタルPCR機器の納入時期が遅れたことなどもあり，検出用のTaqManプローブの設計，検討には至っていない．今後はこれらに優先して取り組んでいく必要がある．

Strategy for Future Research Activity

得られた遺伝子配列情報を用い，NoV GII.3型，GII.17型それぞれに特異的な配列を有するTaqManプローブを設計する．作成したプラスミドDNA等に対し，新規設計したTaqManプローブを用いたデジタルPCRを試みることで，TaqManプローブの特異性を検証するとともに，検出系の最適化を試みる．複数のNoV遺伝子型が混在している場合を含めて定量性の高さ，検出限界，反応の特異性を検証する．検出系の最適化後，収集した試料に対し，新規検出系を適用する．デジタルPCR及びReal-time PCRの両者を適用することで，デジタルPCRの有効性を検証するとともに，水中でのGII-NoV遺伝子型の存在実態を明らかとする．また，各遺伝子型の存在実態について，地点特性や季節変動，他のウイルスとの濃度相関等の観点より，その特性を評価する．