2016 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of a digital PCR-based genotyping method for noroviruses in water
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26820222
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
端 昭彦 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(PD) (70726306)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 水環境 / ノロウイルス / Real-time PCR / デジタルPCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに，環境試料中のノロウイルスの遺伝子配列を解析し，特に検出頻度の高かったGII.3及びGII.17型について390ベース程度の配列を基にプラスミドDNAを作成した．
本年度はデータベース上のノロウイルスの遺伝子配列について，各遺伝子型をカバーするよう，750配列程度を取得し，GII.3型，GII.17型及び長期に渡り重篤な胃腸炎症状を多数引き起こしているGII.4型のそれぞれに特異的なTaqManプローブを設計した．さらに，プラスミドDNA及び設計したTaqManプローブを用い，各遺伝子型のノロウイルスについて，デジタルPCRによる定量タイピング手法を検討した．
デジタルPCRによる定量タイピングにおいては，TaqManプローブとして，遺伝子群 (GII) を網羅的に検出可能なもの (網羅的プローブ) と遺伝子型に特異的なもの (特異プローブ) を同時に用いた．両プローブはそれぞれ異なる蛍光色素で標識し，判別可能とした．デジタルPCRにおいて，遺伝子増幅条件の最適化を試みた結果，プラスミドDNAが高濃度 (10,000 copies程度以上) 存在する場合には網羅プローブ，特異プローブの両者ともに，期待値通りの測定値が得られた．一方で，低濃度域では測定値と期待値に差異が生じた．さらに，遺伝子を添加しないネガティブコントロール系において偽陽性が生じた．なお，本検出系をReal-time PCRに供した場合は，10 copies/reaction程度の低濃度域においても期待値通りの結果が得られた．これらより，本研究で設計した遺伝子検出系はデジタルPCRによる低濃度ウイルスの検出には適さないことが示唆された．今後はさらなる検出系の最適化を試み，測定感度の向上を試みる必要がある．
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