油脂蓄積珪藻からバイオディーゼル原料を放出させ、省エネルギーに回収する技術の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26820357
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 前田 義昌 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (30711155)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 微細藻類 / バイオ燃料 / 遺伝子組み換え / リパーゼ / 組み換えタンパク質 / オレオソーム

Outline of Annual Research Achievements

脂質高生産珪藻Fistulifera solari内に蓄積された油滴状の脂質を分解し、遊離脂肪酸として細胞外に放出することを目指し、遺伝子組み換え技術を用いてリパーゼの過剰発現を試みたところ、細胞毒性の可能性が示唆された。そこで、当該株のトランスクリプトーム解析で得られた情報を基に、細胞が定常期に達し、脂質の蓄積が完了した後にのみに発現する遺伝子（硝酸塩代謝関連遺伝子、トランスポーター遺伝子など）のプロモーターを用いた発現制御システムの構築に取り組んだ。上記のプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝誌を配置した、発現制御ベクターを複数構築し、当該株に導入した。その結果、GFP蛍光を示す形質転換体得られたものの、GFP蛍光は常時確認され、脂質の蓄積が完了した後にのみに発現するという、ネイティブな機能を人工的に再現することはできなかった。これは、発現制御システムの構築には、発現制御ベクターに組み込んだプロモーター配列だけでは不十分であり、その他の転写調節因子結合部位の補助を得る必要があるためであると考えられる。現在、微細藻類においてこれらの転写調節因子結合部位の同定は進んでおらず、今後の研究課題であると考えている。一方で、油滴に局在すると予想されるリパーゼの遺伝子に変異を入れ、加水分解能を失わせた変異型リパーゼとGFPの融合タンパク質発現ベクターを構築し、その局在を確認した。加水分解能を失わせることで、細胞毒性を抑制し、局在解析を容易にすることができた。リパーゼの多くは細胞質に局在することが確認されたが、一部、油滴を包むようにGFP蛍光が局在する様子が観察され、標的リパーゼが油滴と相互作用する可能性が示唆された。今後、当該リパーゼを安定的に、細胞毒性を抑えた条件で発現することにより、油滴中のリパーゼから遊離脂肪酸に分解し、細胞外に放出するシステムを構築できると期待される。