分子プロファイルに基づく聴覚系神経回路のトノトピー形成機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26830011
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 松井 亮介 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80633940)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 音源定位

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに明らかにしたトノトピー形成と関連性の高いと考えられる数十種類の分子に関して、A3Vベクターを用いた過剰発現を行い、神経投射やシナプス形成、神経細胞の配置などの神経回路形成に与える影響を免疫組織染色や蛍光トレーサーの局所注入によって解析を行なった。また、A3Vベクターを用いた蛍光タンパク質の局所的な発現によって神経細胞を可視化し、樹状突起の長さや本数に与える影響を解析を行なった所、多数の分子に関して複数の異なる表現型が観察された。次にこれらの表現型が分子の内在的な機能を反映しているかどうかを解析するため、A3Vベクターを用いてRNA干渉によるノックダウンを行い同様の解析を行なったが、過剰発現による表現型から予想されるようなノックダウンによる影響を観察することは出来なかった。そこで、RNA干渉によるノックダウン実験系の検討を行い、より高いノックダウン効率を示すA3Vベクターの開発に成功した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の目的は、「網羅的な分子プロファイル解析によってトノトピーの形成に関する遺伝的プログラムを明らかにし、申請者が独自に開発した遺伝子操作技術を駆使することでトノトピーの形成機構を解明すること」であり、平成27年度は、トノトピーの形成と関連性の高い分子に関して、A3Vベクターを用いて神経回路選択的・時期特異的に遺伝子操作(過剰発現やRNA干渉によるノックダウン)を行い、神経投射やシナプス形成、神経細胞の配置などの神経回路形成に与える影響を免疫組織染色や蛍光トレーサーの局所注入によって解析し、シグナル伝達の下流に位置すると考えられる分子の発現パターンの変化や、同様の表現型を示す分子の多重導入による影響を解析することで、シグナル伝達経路を明らかにすることを計画していた。しかし、ノックダウン実験が思うように進まなかったことから分子機能の解析や、シグナル伝達経路の解明にまでは至っていない。このため、本研究は当初予定よりもやや遅れていると評価した。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画に従い、新規に開発したより高いノックダウン効率を示すA3Vベクターを用いて神経投射やシナプス形成、神経細胞の配置などの神経回路形成に与える影響を免疫組織染色や蛍光トレーサーの局所注入によって解析し、シグナル伝達の下流に位置すると考えられる分子の発現パターンの変化や、同様の表現型を示す分子の多重導入による影響の解析を行う。
また、もし思ったようにノックダウン実験系が機能しない時は、トノトピー形成と関連性の高いと考えられる分子に関する発現解析をin situ hybridizationにより行うことで、トノトピー形成に関連の深いと考えられる分子の詳細な発現パターンを明らかにする。

Causes of Carryover

当初計画の通り実験が進まなかったことで行なった実験が少なくなり、消耗品費が減ったことから次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

ウイルス作成試料、ウイルス作成用プラスチック類(ピペット、ディッシュ)、実験用動物（鶏卵）、分子生物学実験試薬、分子生物学実験キット類(DNA・RNA抽出キット)に関わる消耗品費として使用する。