2015 Fiscal Year Research-status Report
iPS細胞とゲノム編集による脳発達機構の解明：重複遺伝子SRGAP2の視点から
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26830018
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
石川 充 慶應義塾大学, 医学部, 特任助教 (10613995)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / オルガノイド / ゲノム編集 / 興奮性神経細胞 / 進化生物学 / SRGAP2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで、ヒトiPS細胞を用いた神経細胞の解析では、培養皿上に単層状態で細胞を播種・培養する方法が主流であった。しかし、単層培養では、細胞の自己組織化の進行が妨げられるなど、機能的な再現を試みている実験としては、不向きな点が多かった。そこで、本研究では、脳神経系の細胞の自己組織化が容易に進むように、細胞を浮遊培養することを試みた。この方法の困難とされている点は、Neurosphereのような、神経幹細胞の増殖を行うだけではなく、神経細胞としての成熟化が求められることであった。
実際に、細胞の増殖と、分化・成熟を同時に再現するのは困難であり、様々な条件設定が必要とされた。しかしながら、細胞の培養条件をひとつひとつ検討して、浮遊培養として、細胞塊が肥大しつつも、一定の増殖を終えた細胞群の成熟化を再現することができた。すなわち、当該年度において、脳オルガノイド形成の一端に成功したと考えられる。
一方で、均一な細胞種類から構成される培養系も必要であった。昨年度までに確立していたTet-OnシステムによるNeurogenin2遺伝子の時期特異的発現によるiPS細胞からの直接的、かつ高効率の神経細胞への分化誘導法をさらに効果的に応用して、細胞形態や移動を評価する実験系をほぼ確立させた。
さらに、ゲノム編集技術応用については、TALENからCrspr/Cas9法に変更した。これにより、健常人iPS細胞からの、SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 2 (SRGAP2)遺伝子への変異導入アイソジェニック細胞株の作成を行うためのガイドRNA構築を行った。最終年度にむけて、ヒトと非ヒト霊長類との脳の構造の差異に迫るような、遺伝子（SRGAP2をはじめとした）、に着目して、ゲノム編集を施した細胞株群と対照群との比較を細胞形態や細胞移動といった視点に特に着目して、個々の遺伝子の機能という視点からヒトに特異的な機能の獲得の謎に迫りたいと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず、本研究で必要とされていた立体浮遊培養の構築を行うことができた。具体的には、iPS細胞から均質な胚様体（EB）様細胞塊を低接着well型プレートで培養して、その後、細胞外基質で細胞塊を表面コーティングした後に、低接着フラスコに移行して、浸透培養を行った。この結果、細胞塊のサイズが大きくなりつつも深部まで酸素透過性の高い立体培養が出来上がり、細胞深部は細胞増殖を行い、表面に向かってIn-side out型の細胞移動を行うオルガノイド培養が完成した。この点は、当初予定していた培養方法と異なり、予想を大幅に超える技術的進歩があったと考えられる。
また、均一細胞腫の分化誘導技術（Neurogenin2遺伝子の一過性強制発現）の技術により、細胞形態や移動を正確に評価できるようになった。また、この手法は均一ポピュレーション細胞集団を作り出すという観点から、トランスクリプトームやプロテオーム解析を行った場合でも非常に信頼性の高いことが予想される。
一方、SRGAP2遺伝子のゲノム編集は一部難航していた。本研究においては、当初TALENを用いたゲノム編集iPS細胞株を考えていたが、編集効率の悪さが問題であった。しかしながら、Cripsr/Cas9システムに移行して、ゲノム編集を行うべく、ガイドRNAの構築を行うことにした。さらに、ヒトiPS細胞への遺伝子導入効率が悪いことが問題視されていたが、こちらも、エレクトロポレーション法を用いた、高効率の遺伝子導入を行うことに成功した。したがって、総合的におおむね順調に研究は進行したと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
SRGAP2遺伝子をはじめとした、ヒト脳の進化に関係した遺伝子を操作すべくゲノム編集技術を適用し、より効率的な編集方法を模索する。 一方、これらの細胞株と対照群とを比較するための、良い培養系として、iPS細胞由来脳オルガノイド培養法を適用する。また、必要に応じて、生化学的アプローチを行うための均一種類細胞集団を構成するためにTet-On-Neurog2遺伝子発現系も活用する。
以上の方法を用いて、ヒトが特異的な高次機能を取得した原因を遺伝子レベルから迫る。具体的には、脳のサイズや、層構造の精密さを一部の遺伝子群が担っていることから、これらの遺伝子群の寄与を細胞形態や細胞移動といった現象の観察を行っていく予定である。また、場合によっては、非ヒト霊長類細胞株を用いて細胞集団の構成の違いを検証する。
なお、ゲノム編集によって構築した変異株については、Crspr/Cas9によるオフターゲット効果を検証するために、場合によっては全ゲノムシーケンスまたはエクソームシーケンスをする可能性がある。
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| Causes of Carryover |
ゲノム編集に用いる試薬のコストダウンに伴い、当初予定していた使用額よりも減少した。さらに、TALENからのCrspr/Cas9法への変更に伴い、試薬使用頻度そのものが減少した。また、当初計画予定の海外学会発表は、当該年度において、日本国内で開催される別途の国際学会（関東圏内）にあてたため、この分の実質的な旅費は無しとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度に使用予定であった、ゲノム編集用のKitや細胞培養関連の試薬類の購入や維持培養に充てる。
また、Crispr/Cas9法では、オフターゲット効果が予想されるため、全ゲノムあるいはエクソームシーケンスをする可能性がある。また、前年度行わなかった海外地での発表に関しては次年度（米国）に行う予定である。
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[Journal Article] Establishment of In Vitro FUS-Associated Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis Model Using Human Induced Pluripotent Stem Cells.2016
Author(s)
Ichiyanagi N, Fujimori K, Yano M, Ishihara-Fujisaki C, Sone T, Akiyama T, Okada Y, Akamatsu W, Matsumoto T, Ishikawa M, Nishimoto Y, Ishihara Y, Sakuma T, Yamamoto T, Tsuiji H, Suzuki N, Warita H, Aoki M, Okano H.
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Journal Title
Stem Cell Reports
Volume: 6
Pages: 496-510
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Functional Neurons Generated from T Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Neurological Disease Modeling2016
Author(s)
Matsumoto T, Fujimori K, Andoh-Noda T, Ando T, Kuzumaki N, Toyoshima M, Tada H, Imaizumi K, Ishikawa M, Yamaguchi R, Isoda M, Zhou Z, Sato S, Kobayashi T, Ohtaka M, Nishimura K, Kurosawa H, Yoshikawa T, Takahashi T, Nakanishi M, Ohyama M, Hattori N, Akamatsu W, Okano H
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Journal Title
Stem Cell Reports
Volume: 6
Pages: 422-435
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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