2014 Fiscal Year Research-status Report
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26830047
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤原 一志郎 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (80638495)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 神経分化 / RanGAP1 / SUMO化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
発達過程におけるマウス胎仔脳や、マウス胎仔大脳皮質由来の神経前駆細胞を用いた実験から、RanGAP1がニューロン分化直後に脱SUMO化と分解を受けることが分かっていたが、さらに神経前駆細胞において、RanGAP1は大部分がSUMO2により修飾されており、SUMO2修飾RanGAP1のみが脱SUMO化と分解を受けることが分かった。SUMO2修飾基質の脱SUMO化を主に行い、また核膜孔複合体に局在するSUMO proteaseはSenp2であることから、神経分化過程におけるSenp2の発現を検討したところ、Senp2は神経前駆細胞ではプロテアソームで分解され、非常に不安定であるが、ニューロン分化と共に安定し、核膜孔に局在することが分かった。また、Senp2を単独で発現させてもRanGAP1の脱SUMO化はほとんど起きなかったが、Necdinと共発現することで脱SUMO化が亢進することが分かった。RanGAP1は、核-細胞質間輸送の制御に関わることから、ニューロン分化過程の核-細胞質間輸送を視覚化するために、GFPにSV-40の核局在化シグナル(NLS)と、HIV-revの核外移行シグナル(NES)を付加した融合蛋白質 (GFP-NLS-NES)をレンチウイルスベクターにより神経前駆細胞に発現させ、培養条件化でニューロンへ分化させた。その結果、神経前駆細胞において核で強く発現していたGFP-NLS-NESは、ニューロンにおいては細胞質において主に発現しており、その細胞内局在が変化していた。この細胞内局在の変化は、胎生14.5日目のマウス脳にエレクトロポレーション法を用いてGFP-NLS-NESを発現させた結果でも同様に観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの実験結果から、RanGAP1が脱SUMO化と分解を受けることは分かっていたが、SUMO2修飾フォームのRanGAP1のみが脱SUMO化と分解を受けることが分かった。さらにRanGAP1の脱SUMO化と発現減少は、ニューロン分化誘導後6時間程度で起きることが分かった。また6つのSUMO proteaseのうちSenp2がRanGAP1の脱SUMO化に重要な役割を果たすことを突き止めた。Senp2、Necdin単独ではRanGAP1の脱SUMO化はほとんど起きなかったが、Necdinとの共発現により脱SUMO化を促進することが分かった。次にRanGAP1の発現減少の生理学的役割を解析するために、GFP-NLS-NES融合蛋白質をレンチウイルスを用いて神経前駆細胞に発現させ、ニューロンへ分化させた。その結果、神経前駆細胞で主に核で発現していたGFP-NLS-NESはニューロンでは主に細胞質で発現していた。RanGAP1以外にRanを介した核-細胞質間輸送に関わる、RanBP1やRanBP2、CRM1、RCC-1は分化前後でほとんど変化しない、もしくはRanGAP1よりもかなり遅れて減少していたことから、分化初期に起こる核-細胞質間輸送の変化にはRanGAP1が重要な役割を果たすと考えられる。これらの結果は、当初の研究計画通りに進行しており、交付申請書に記載した研究目的の達成度について、「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の結果から、RanGAP1の脱SUMO化のメカニズムは、SUMO proteaseの同定と、Necdinの関与の点で明らかになった。またニューロン分化過程における核-細胞質間輸送の視覚化から、RanGAP1の発現減少と核-細胞質間輸送の変化との関連が認められた。今後の研究推進方策としては、申請書類の計画に従い、神経前駆細胞の内在性のRanGAP1の発現を抑制した場合に、核-細胞質間輸送やニューロン分化に変化が起こるのかin vitroニューロン分化系で検討する。またその方法としてはレンチウイルスや、エレクトロポレーション法によるRNAiを用いる。このin vitroニューロン分化系で変化がみられた場合は、in utero遺伝子導入系を用いて個体レベルでの検討を行う。また、NecdinやSenp2の関与をより検証するために、神経前駆細胞のNecdinやSenp2の発現をRNAiで抑制した場合のRanGAP1のSUMO化や、発現レベルに変化があるのかを検討する。本年度、RanGAP1のSUMO化リジンをアルギニンに置換した変異体を神経前駆細胞に発現させ、ニューロンへ分化させた場合の安定性の違いについて野生型と比較した結果、変異体は野生型と同様に分化後に分解を受けていた。このことから、SUMO化リジンとユビキチン化リジンは別である可能性が示唆される。しかし、ニューロン分化に伴うRanGAP1の発現減少は、プロテアソームの阻害剤であるMG132により緩やかになるため、RanGAP1の発現減少にはユビキチン-プロテアソームが関与している可能性が高い。よって他のリジンを候補としてユビキチン化の検討をを行う必要があると考える。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由としては、今年度は主にin vitro系を用いた実験を行い、実験動物等に計画していた額が少なかったため、また当初計画していた外国、国内への旅費が今年度に支出されなかったためであると考える。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度では、動物を用いた個体レベルの解析を進める、また積極的に国内、海外の学会において成果発表を行う。また論文投稿のための費用として使用することを計画している。
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