2014 Fiscal Year Research-status Report
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26830071
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
梶原 健太郎 大阪大学, 微生物病研究所, 特任研究員(常勤) (30581102)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Src / 脂質ラフト / 上皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん原遺伝子産物Srcは様々ながん組織でその発現の亢進と活性化が認められ、がん化・がんの悪性化に重要なタンパク質のひとつである。しかしSrcの活性制御機構の全貌はわかっていない。本研究では、Srcの活性制御機構を空間的、時間的に理解すること、さらにがん化との関連を明らかにすることを目的としている。
MDCK細胞にSrc活性化誘導システムを導入して、活性化にともなうSrcの細胞内動態を観察した。その結果、Srcは活性化後ただちに形質膜に移行することが明らかになった。この時、活性化Srcは脂質ラフト画分に急速に濃縮されることがわかった。これらの結果から、活性化Srcは脂質ラフト内に存在する未知のタンパク質によってリクルートされることが推察された。そこで脂質ラフト内でSrcと結合するタンパク質を免疫沈降法で回収し、質量分析で解析した結果、新規タンパク質Rsp1を得た。Rsp1は形質膜に限局して存在しており、Src結合部位と脂質ラフト移行シグナルを有していた。このタンパク質を過剰発現させると、活性化Srcが脂質ラフト内にトラップされた。以上の結果から、活性化SrcはRsp1によって脂質ラフト内にリクルートされることが考えられた。
Rsp1が過剰発現しているMDCK細胞を三次元培養すると、一部の細胞が異常伸張していた。しかし、脂質ラフトに移行できない変異Rsp1の過剰発現では細胞伸張は観察されなかった。Rsp1-GFP発現誘導システムを構築して、Rsp1による伸張過程を観察した結果、GFP陽性細胞が基底膜を破壊しながら伸張している様子が見られた。以上の結果から、Rsp1の過剰発現によって活性化Srcが脂質ラフトに集積すると、がんの浸潤様の異常伸張が引き起こされると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1) Rsp1の同定：本研究の最優先事項である「Srcリクルートタンパク質の同定」をRsp1の発見によって達成することができた。ターゲットタンパク質が絞れたことによって、以後の研究がスムースに展開すると考えられる。すでにRsp1の機能に重要なドメインの同定に着手している。
2) Srcによる細胞の異常伸張現象の発見：Rsp1の局在を変えることによって、活性化Srcの集積場所をコントロールすることが可能になり、Src活性化を空間的に制御することができるようになった。これによって、Srcが脂質ラフトに集積する場合のみ細胞が異常に伸張することが明らかになった。がん細胞の浸潤との関連も確認できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) 細胞伸張現象の解析：細胞の異常伸張現象を理解するために、Rsp1-GFP発現誘導システムを活用して、伸張過程を観察する。さらに、その時の細胞内外で起こる現象を可視化することで、伸張現象の原因を探る。
2) シグナル伝達の解析：細胞の異常伸張に関与するシグナル伝達経路を特定する。Rsp1の強制発現やノックダウンによって、Src下流のシグナル伝達がどのように変化するかをウェスタンブロッティングで網羅的に解析する。関与が推測される経路が見つかった場合は、阻害剤やドミナントネガティブ変異体を利用して、異常伸張への寄与を解析する。
3) がん形質との関連の解析：Rsp1による細胞伸張と浸潤の関連を解析する。様々ながん細胞でのRsp1の発現レベルを解析して、Rsp1の発現変動時の浸潤の様子を解析する。
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| Causes of Carryover |
研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため、当初の使用見込み額と執行額は異なった。しかし、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初の予定通りの計画を進めていく。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度は、前年度までに構築した解析系での解析が中心となるため、消耗品費にウェイトをおく。研究遂行に必要な装置設備は購入しない。
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