膵癌におけるSMAD4の発現と微小環境構築による癌進展メカニズムの解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26830081
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 廣島 幸彦 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (60718021)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 膵癌 / 間質 / 微小環境 / TGFβ / プロテオーム解析 / マウスモデル / PDX

Outline of Annual Research Achievements

（１）膵癌細胞株同所移植モデルの作成：数種類の膵癌細胞株のSMAD4の発現量をRealtime PCRを用いて測定し、 SMAD4野生型（MiaPaca2）と欠失型（BxPC3）を同定した。SMAD4野生型、欠失型、各々の膵癌細胞株をヌードマウスの皮下に1x106 cells移植し、数週間後、成長した皮下腫瘍片を摘出、細分化し、RFP発現トランスジェニックヌードマウスの膵尾部に移植した。
（２） TGFβR1阻害薬によるTME変化のintravital realtime imaging：上記２種のモデルにおいて、腫瘍がヌードマウス内で成長したのを確認後、マウスにTGFβR1阻害薬を腹腔内投与する。麻酔下にマウスの膵尾部を露出し、投薬前から投薬後6週間まで1週間毎に腫瘍径を測定した。また共焦点レーザー顕微鏡を用い、腫瘍内部のTMEの変化を観察した。その結果、SMAD4欠失型（BxPC3）の方が野生型（MiaPaca2）と比較し有意に間質の面積が広く、SMAD4欠失型（BxPC3）腫瘍の担癌マウスにTGFβR1阻害薬を腹腔内投与すると、Vehicleと比較し腫瘍径は有意に増大したが、腫瘍内の間質量は有意に低下した（未発表データ）。
（３） SMAD4野生型、欠失型膵癌のTMEにおける発現蛋白の網羅的解析：膵切除検体から凍結切片を作成し、免疫染色にてSMAD4の発現レベルを確認し、LMDにて間質部分のみをサンプリングした。さらにLMDサンプルから蛋白を抽出し、液体クロマトグラフィーにて抽出蛋白を分離、質量分析器にて発現蛋白を同定、定量（LC FT-LTQ MS）し、1500以上の蛋白を同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、膵癌細胞株の中からSMAD4野生型（MiaPaca2）と欠失型（BxPC3）を同定し、SMAD4野生型、欠失型、各々のFluorescent-stroma modelモデルを作成した。さらに、上記２種のモデルにおいて、腫瘍内の間質量を測定したところ、SMAD4欠失型（BxPC3）の方が野生型（MiaPaca2）と比較し有意に間質の面積が広かった。次にSMAD4欠失型（BxPC3）腫瘍の担癌マウスにTGFβR1阻害薬を腹腔内投与すると、Vehicleと比較し腫瘍径は有意に増大したが、腫瘍内の間質量は有意に低下するという興味深い結果を得た。また、LMDサンプルから蛋白を抽出し、液体クロマトグラフィーにて抽出蛋白を分離、質量分析器にて発現蛋白を同定、定量（LC FT-LTQ MS）し、1500以上の蛋白を同定した。以上の結果から概ね予定通りに研究が進んでいると判断した。

Strategy for Future Research Activity

昨年度は細胞株のFluorescent-stromaモデルを用いた実験を主に行った。今後はSMAD4野生型、欠失型、各々のFluorescent-PDXモデルを用いて、腫瘍内の間質量の比較やTGFβR1阻害薬投与による腫瘍径や間質量の変化を同様に測定していく予定である。また、プロテオーム解析により同定された分子群をネットワーク解析ソフト（KMデータ）を用い、シグナル別に整理し、TME関連候補分子を同定する。

Causes of Carryover

継代中であったSMAD4欠失型Fluorescent-PDXモデルが感染し使用不能となったため、Fluorescent-PDXモデルを用いた動物実験が施行できなかったため。また、蛍光色素（DyLite® 650）を投与し、TMEの変化とDrug deliveryへの影響について共焦点レーザー顕微鏡を用いてintravital realtime imagingすることにより観察する予定であったが、650nm用の励起光を発するレーザーのGeneratorが故障し、観察不能となり、実験が一時中断したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

新たにSMAD4欠失型のFluorescent-PDXモデルを作成できたので、それを用いて腫瘍内の間質量の比較やTGFβR1阻害薬投与による腫瘍径や間質量の変化を同様に測定していく予定である。また、蛍光色素（DyLite® 650）に代わりにAlexa405を用いてTMEの変化のDrug deliveryへの影響について共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Selective efficacy of zoledronic acid on metastasis in a patient-derived orthotopic xenograph (PDOX) nude-mouse model of human pancreatic cancer. (2015)
  • Author(s): Hiroshima Y, Maawy AA, Katz MH, Fleming JB, Bouvet M, Endo I, Hoffman RM.
  • Journal Title: J Surg Oncol. Volume: 111(3) Pages: 311-5
  • DOI: 10.1002/jso.23816.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Metastatic Recurrence in a Pancreatic Cancer Patient Derived Orthotopic Xenograft (PDOX) Nude Mouse Model Is Inhibited by Neoadjuvant Chemotherapy in Combination with Fluorescence-Guided Surgery with an Anti-CA 19-9-Conjugated Fluorophore. (2014)
  • Author(s): Hiroshima Y, Maawy A, Zhang Y, Murakami T, Momiyama M, Mori R, Matsuyama R, Katz MH, Fleming JB, Chishima T, Tanaka K, Ichikawa Y, Endo I, Hoffman RM, Bouvet M.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: ２;9(12) Pages: e114310
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0114310
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Efficacy of tumor-targeting Salmonella typhimurium A1-R in combination with anti-angiogenesis therapy on a pancreatic cancer patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) and cell line mouse models. (2014)
  • Author(s): Hiroshima Y, Zhang Y, Murakami T, Maawy A, Miwa S, Yamamoto M, Yano S, Sato S, Momiyama M, Mori R, Matsuyama R, Chishima T, Tanaka K, Ichikawa Y, Bouvet M, Endo I, Zhao M, Hoffman RM.
  • Journal Title: Oncotarget. Volume: 15;5(23) Pages: 12346-57
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Efficacy of Salmonella typhimurium A1-R versus chemotherapy on a pancreatic cancer patient-derived orthotopic xenograft (PDOX). (2014)
  • Author(s): Hiroshima Y, Zhao M, Maawy A, Zhang Y, Katz MH, Fleming JB, Uehara F, Miwa S, Yano S, Momiyama M, Suetsugu A, Chishima T, Tanaka K, Bouvet M, Endo I, Hoffman RM.
  • Journal Title: J Cell Biochem. Volume: 115(7) Pages: 1254-61
  • DOI: 10.1002/jcb.24769
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The tumor-educated-macrophage increase of malignancy of human pancreatic cancer is prevented by zoledronic acid. (2014)
  • Author(s): Hiroshima Y, Maawy A, Hassanein MK, Menen R, Momiyama M, Murakami T, Miwa S, Yamamoto M, Uehara F, Yano S, Mori R, Matsuyama R, Chishima T, Tanaka K, Ichikawa Y, Bouvet M, Endo I, Hoffman RM.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 12;9(8) Pages: e103382
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0103382
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. (2014)
  • Author(s): Hiroshima Y, Maawy A, Zhang Y, Sato S, Murakami T, Yamamoto M, Uehara F, Miwa S, Yano S, Momiyama M, Chishima T, Tanaka K, Bouvet M, Endo I, Hoffman RM.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 12;9(6) Pages: e99977
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0099977
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore in combination with neoadjuvant chemotherapy inhibits metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model (2015)
  • Author(s): Yukihiko Hiroshima1, Ali Maawy2, Yong Zhang3, Takashi Murakami4, Masashi Momiyama4, Ryutaro Mori4, Ryusei Matsuyama4, Matthew H. Katz5, Jason B. Fleming5, Takashi Chishima4, Kuniya Tanaka4, Yasushi ichikawa4, Itaru Endo4, Robert M. Hoffman6, Michael Bouvet
  • Organizer: 米国癌学会（AACR annual meeting 2015）
  • Place of Presentation: Philadelphia、米国
  • Year and Date: 2015-04-18 – 2015-04-22
• [Presentation] Efficacy of photo-immunotherapy in combination with surgical resection on a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) (2015)
  • Author(s): Yukihiko Hiroshima1, Ali Maawy2, Takashi Murakami1, Nzola De Magalhães2, Daisuke Kawaguchi3, Kenichi Matsuo3, Kuniya Tanaka3, Michael Bouvet2, Robert M. Hoffman2, Itaru Endo1.
  • Organizer: 米国癌学会（AACR annual meeting 2015）
  • Place of Presentation: Philadelphia、米国
  • Year and Date: 2015-04-18 – 2015-04-22
• [Presentation] The correlation between the change of future remnant liver volume and functional capacity in ALPPS (associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy), and establishment of ALPPS model in rats (2015)
  • Author(s): Daisuke Kawaguchi1, Yukihiko Hiroshima1, Takashi Murakami1, Kenichi Matsuo1, Chihiro Kosugi1, Kiyohiko Syuto1, Akimitsu Yamada2, Itaru Endo2, Keiji Koda1, Kuniya Tanaka
  • Organizer: 米国癌学会（AACR annual meeting 2015）
  • Place of Presentation: Philadelphia、米国
  • Year and Date: 2015-04-18 – 2015-04-22
• [Presentation] Curative fluorescence-guided surgery of pancreatic cancer in combination with UVC irradiation in orthotopic mouse models (2015)
  • Author(s): Yukihiko Hiroshima1, Ali Maawy2, Yong Zhang1, Sho Sato3, Takashi Murakami1, Mako Yamamoto1, Fuminari Uehara1, Shinji Miwa1, Shuya Yano1, Masashi Momiyama3, Takashi Chishima3, Kuniya Tanaka3, Michael Bouvet2, Itaru Endo3, Robert M. Hoffman
  • Organizer: 米国癌学会（AACR annual meeting 2015）
  • Place of Presentation: Philadelphia、米国
  • Year and Date: 2015-04-18 – 2015-04-22
• [Presentation] luorescence-guided surgery of liver metastasis in orthotopic nude-mouse models (2015)
  • Author(s): Takashi Murakami1, Yukihiko Hiroshima1, Shinji Miwa1, Yano Shuya1, Makoto Toneri1, Mako Yamamoto1, Masashi Momiyama2, Takashi Chishima2, Kuniya Tanaka2, Michael Bouvet1, Satoshi Hasegawa2, Itaru Endo2, Robert M. Hoffman
  • Organizer: 米国癌学会（AACR annual meeting 2015）
  • Place of Presentation: Philadelphia、米国
  • Year and Date: 2015-04-18 – 2015-04-22