2016 Fiscal Year Annual Research Report
Functional screening of the genes involved in Xist function and pluripotency
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26840006
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
大畑 樹也 浜松医科大学, 医学部, 助教 (80616459)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / X染色体不活性化 / 非コードRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、Xist機能付加因子及びリプログラミング因子の網羅的同定である。胚性幹細胞（ESC）では、X染色体不活性化／再活性化はXist依存的におこる。我々は独自の実験により、エピブラスト幹細胞（EpiSC）におけるXist依存性の消失を明らかにした。本研究は、そのXist機能付加因子の単離・同定を目的としている。また、平行してEpiSCからESCへの変換に必要な遺伝子（リプログラミング因子）の単離も行う。
本研究は、（１）Xist/Tsix発現誘導ESC/EpiSCの樹立（実験系の開発と確立）（２）遺伝子発現ライブラリーの構築（選別の下準備）（３）候補遺伝子群の単離および機能解析、の３段階に分けられる。研究期間中に、CRISPR/Cas9を利用した遺伝子破壊用のライブラリーが開発されたため、本申請実験を、遺伝子機能付加スクリーニングから、遺伝子機能欠失スクリーニング系に変更した。
昨年度までは、Xist/Tsix発現誘導ESCの樹立を行った（第一段階）。XTTGFP/XTTGFPマウス（XTTGFP：Xistの抑制因子であるTsixの発現誘導アリル＋X染色体連鎖GFP遺伝子）とXTX/Yマウス（XTX：Xistの発現誘導アリル）を導入・交配し、XTTGFPXTX ESCを樹立した。その細胞のXTX側X染色体のHprt遺伝子座にCRISPR/Cas9法を用いてmCherry遺伝子をノックインした（XTTGFP/XTXmCherry ESC）。
本年度は、CRISPRライブラリーを入手し、レンチウイルス感染の為の実験系を確立した。また、平行してXTTGFP/XTXmCherry ESCにCas9遺伝子を導入した。この様に、本年度は実験の第二段階（選別の下準備）まで完了する事ができた。第三段階（候補遺伝子群の単離および機能解析）に向けて、実験は現在も進行中である。
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