2014 Fiscal Year Research-status Report
再構成OPA1を用いたミトコンドリア内膜融合機構の解明
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26840026
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
伴 匡人 久留米大学, 分子生命科学研究所, 講師 (00579667)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / 膜融合 / GTPase / 膜蛋白質 / プロテオリポソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
OPA1はダイナミンファミリーに属するGTPaseであり、ミトコンドリア内膜融合に於いて中心的な役割を担っている。生体内でOPA1は、他のダイナミン様GTPaseと同様に、GTP加水分解によるエネルギーを使い、膜の形態制御に関わると考えられているが、その分子機構は明らかにされていない。
平成26年度の研究では、まずOPA1の挙動を明らかにするために、リコンビナントOPA1発現・精製及び、OPA1プロテオリポソームによる膜融合アッセイを確立した。さらに膜融合アッセイから、OPA1がミトコンドリア外膜融合や小胞体の融合に関わるGTPaseとは異なる膜融合機構を持つことを示した。続いて、膜融合に於ける脂質膜の組成の寄与を解析し、カルジオリピンが融合を推進することを示した。これらの結果から、OPA1の膜融合には、OPA1とカルジオリピンとの特異的な相互作用が必至であり、OPA1のGTP結合・加水分解により制御されることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜融合アッセイの確立及び、OPA1が他の膜融合を制御するGTPaseとは異なる膜融合機構を持つことを示すことができたので、研究はおおむね順調に進展していると思われる。
本研究では、OPA1プロテアリポソームを使い、膜融合に於けるOPA1の挙動を明らかにすることを目的としている。これにはまずリコンビナント蛋白質の発現・精製が必要となるが、膜貫通領域を持つOPA1の先行研究は無く、独自に発現・精製方法を確立する必要があった。詳細な条件検討により、リコンビナント蛋白質の可溶化の問題を解決したことで、効率よく研究を進めることができるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、脂質膜上でのOPA1の会合状態やコンフォメーション変化に与えるGTP加水分解の寄与を解析する。またOPA1プロテオリポソームから得られた研究結果が、培養細胞で実際に生じるミトコンドリア膜融合にも反映するかを明らかにし、OPA1による膜融合の分子機構を明らかにしたい。
さらに平成26年度の研究から得た知見や経験を、ミトコンドリア外膜の融合因子の発現に応用し、ミトコンドリア膜融合システムを網羅的に解析する実験系の確立を目的とした研究も継続したい。
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| Causes of Carryover |
研究が順調に進んでおり、平成27年度は今後の研究の推進方策でも記述したとおり、実験計画にある「ミトコンドリア膜融合システムを網羅的に解析する実験系の確立」のための研究を行う。実験系の確立には、多くの条件検討が必要となるために、平成26年度よりも多くの消耗品等の購入が予想されるので、繰越を行った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成26年度の繰越分と、研究計画にある平成27年度の配分予算を使い、用いる界面活性剤の濃度や種類を変えるなど、より多くの条件を検討し、研究目的の達成を目指す。また得られた結果に応じて、精製度の高い蛋白質が必要となった場合は、クロマトグラフィーシステムなどの備品購入に使用する。
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