2015 Fiscal Year Research-status Report
ビタミンB12を感光色素とする新規光センサーの構造機能研究
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26840027
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
村木 則文 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 特任助教 (20723828)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 光受容体 / 結晶構造解析 / ビタミンB12 / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ビタミンB12（アデノシルコバラミン）が高い光感受性をもち、光分解することは50年以上前から知られていた。しかし、ビタミンB12を感光色素とするセンサータンパク質の存在は近年まで明らかでなかった。2011年にコバラミン依存型転写因子CarH/LitRが光受容体として機能することが報告されると、2014年にはコバラミン結合タンパク質AerRが転写因子CrtJと光依存的に相互作用することで転写調節することが報告された。いずれの系も構造生物化学的知見には乏しく、アデノシルコバラミンの光依存的な構造変化が転写制御をもたらすシグナル伝達メカニズムの詳細は明らかでない。本研究では、エックス線結晶解析法によってCarHとAerRの立体構造を決定し、光応答に伴う動的な構造変化を捉えることでコバラミン依存型光センサーの分子機構の解明を目指している。
本研究では、Thermus thermophilus 由来のCarHとMyxococcus xanthus 由来のCarH、光合成細菌由来のAerRを研究対象として取組んでいる。2015年度は結晶化に適した高純度・高濃度の試料調製に成功しているT. thermophilus 由来CarHの結晶化条件の検討と最適化を進めた。光応答前のCarHの構造情報を得るために、暗所において赤色光 (660 nm) 下において結晶化条件の検討を行った。その結果、PEGを沈殿剤とする条件で晶系の異なる2種類の結晶を得た。これらの結晶を用いて、SPring-8において回折データを収集し、構造解析に成功した。一方の結晶から、N末端81アミノ酸が切れたCarHの構造を2.5オングストローム分解能で決定した。もう一方の結晶から、CarH全長の構造を3.0オングストローム分解能で決定した。いずれも四量体を形成しており、生理的条件を反映していると考えられる。現在、これらの構造を詳細に検討して光応答機構についての考察を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
T. thermophilus 由来CarHの光反応前の結晶構造を決定することができた。暗所における実験は制約が多く、特に結晶の取り扱いは困難であったが、考察するに十分な質の結晶構造が得られたことは大きな成果である。光受容体研究において光反応前の構造情報は光応答機構を知る上で非常に重要であり、当初の計画以上に進展が見られたといえよう。
その一方で、光反応後のCarHの結晶は依然として得られていない。光反応後のCarHをミミックすると考えられるシアノコバラミン結合型CarHの結晶化も検討しているが結晶は得られていない。暗所型に比べて実験上の制約が少ないため、結晶化条件のスクリーニングを広く展開しているが成功には至っていない。光反応後のCarHはDNA結合能を有しておらず、変性領域を多く含む可能性も考えられる。
また、もう一つのビタミンB12依存型新規光センサーであるAerRも結晶化には至っていない。AerRは大腸菌発現系において大量発現に成功しているが、精製収率が著しく低く、それに伴って精製純度も不十分であることが挙げられる。また、AerRのコバラミンの含有率は30%程度であり、様々な手法で含有率の向上を検討したが成功には至っていない。結晶化に適さない不均一な標品しか得られていない点が大きな問題である。
このように、非常に大きな進展があった一方、昨年以降ほとんど進展が見られなかった試料もあり、プロジェクト全体としてこのように自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた構造情報を基にして機能解析を行い、CarHの光応答機構の詳細を明らかにすることが最終年度の目標である。初めに、アデノシルコバラミン結合型CarH四量体の結晶構造から、機能発現に重要なアミノ酸残基を見出す。重要なアミノ酸に変異導入した改変型CarHを設計する。改変型CarHを調製して、光応答・四量体形成・DNA結合能などについて各々機能解析を行い、当該アミノ酸の重要性について検証したいと考えている。
また、光応答後のCarH、あるいはそれをミミックすると予想されるシアノコバラミン結合型CarHの結晶構造は光応答前後におけるCarHの構造変化を捉えるためには重要であり、引き続き結晶構造解析を目指した研究を進める。先述の結晶構造解析の結果、フレキシブルであることがわかったN末端ドメインを切断したtruncated型CarHを調製しており、その結晶化を試みる。また、CarH四量体とDNA複合体の結晶化も検討する。
AerRは様々なコンストラクトを作成して大量調製を目指してきたが、結晶化に適した純度の試料は得られていない。これまでにAerRは複数の光合成細菌において同定されてきており、最終年度は異なる生物種に由来するAerRについて大腸菌による大量発現・調製系の確立を目指す。結晶構造が得られれば、CarHの結晶構造と比較することにより、本研究課題の最終目標であるビタミンB12を感光色素とする新規光センサーの理解につなげたい。
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| Causes of Carryover |
2015年度はCarHの結晶構造解析を目的として、海外の放射光施設を利用する機会があり、当初の予定よりも旅費が多くなっている。結晶化実験には、精製用の試薬と結晶化用試薬が必要であり、当該年度ではこれらの試薬も大量に消費した。しかし、いずれも昨年度に購入した試薬で間に合ったために新規購入した試薬が少なく、次年度使用額が増えた。改変型CarHやAerRの各種コンストラクトの作成を次年度に延ばしたことも増額の一因である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度は改変型CarHやAerRのコンストラクトを作成し、それらの結晶化条件のスクリーニングを予定している。コンストラクトの作成に必要な核酸合成や結晶化条件のスクリーニングキットが新たに必要となる。また。これまで精製に用いていた精製用樹脂等にも劣化・老朽化が見られており、ハイスループットな試料調製のために更新が必要である。
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Research Products
(4 results)
