2015 Fiscal Year Research-status Report
ヘムオキシゲナーゼ2の天然変性領域が介する新規酵素活性調節機構の解明
| Project/Area Number |
26840040
|
|---|
| Research Institution | Yokohama City University |
|---|
Principal Investigator |
古川 亜矢子 横浜市立大学, 生命医科学, 特任助教 (90453050)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 蛋白質の動的構造解析 / 酵素の調節機構 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
HO-2は小胞体膜結合タンパク質であり、ヘム結合領域を含む構造領域、C末端側に2箇のCysを含む天然変性領域、膜結合領域から成る。生体内には、HO-2の様に構造領域と膜結合領域の間に天然変性領域を含む表在性膜タンパク質が多く存在する。しかしながら、この天然変性領域の機能についてはあまり解析がなされていない。まず、C末端領域を含むlong HO-2と含まないshort HO-2の酵素活性を比較した結果、long HO-2は、short HO-2より1.5倍酵素活性が高いことが分かっていた。NMRの動的構造解析から、C末端の天然変性領域が酵素活性に重要な構造領域と弱く相互作用することで、動的構造を変化させていることが明らかになっていた。C末端領域を含むlongHO-2と含まないshortHO-2のMD simulationを行った結果、longHO-2の方が構造領域の構造に多様性があることがわかった。これは、long HO2のR2 dispersionの結果から動的構造変化が大きくなった残基が多く存在することと一致していた。この現象をin vivoでも検証するために、HO-1/HO-2コンディショナルノックアウトマウスから、HO-1/HO-2をダブルKOしたMEF細胞を作製した。この完全にKOした細胞にwtHO-2とmutantHO-2を過剰発現させた細胞を作製し、酵素活性のアッセイ方法の検討を行った。更に、Heminを含む培地での細胞の増殖スピードを比較した結果、数日たつとHeminへの耐性を持つ細胞だけが増殖した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
HO-1/HO-2コンディショナルダブルノックアウトマウスから、Creを用いてHO-1/HO-2をダブルKOしたMEF細胞を作製した。続いて、KOされた細胞にwtHO-2とmutantHO-2を過剰発現させた細胞を作製した。これらの細胞に対してHeminへの耐性を調べた結果、数日するとHeminへの耐性を持つ細胞だけが増殖した。つまり、HO-1/HO-2のKOされていない細胞が混ざっていることが分かった。そこで、再度シングルセルクローニングにより完全にHO-1/HO-2をダブルKOしたMEF細胞を作製したことにより予定より遅れている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
HO-1/HO-2をダブルKOしたMEF細胞にwtHO-2とmutantHO-2を過剰発現させた細胞を用いて、Heminを添加した際の酵素活性のアッセイ方法の確立を行う。MEF細胞は不死化しているため、普通の細胞よりもHeminへの耐性濃度などが高く、Heminを分解する酵素活性を測るための検討が必要である。
|
| Causes of Carryover |
平成27年9月から12月まで、産前産後休暇取得のため当初の予定通り実験を進めることが出来なかったため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
13C,15N, 2H標識したHO-2蛋白質を発現する際の培地として、13C,15N標識培地及び重水に使用する予定である。酵素の活性測定などに生化学実験用試薬、細胞実験のための分子生物学実験用試薬に使用する。
|
