2014 Fiscal Year Research-status Report
新規単分子蛍光観察法によるがん抑制因子p53のDNA探索機構の解明
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26840045
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
鎌形 清人 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (90432492)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 単分子計測 / DNA / 天然変性蛋白質 / 探索 / 結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
天然変性蛋白質であるp53がDNA上の標的配列を探索する仕組みを明らかにするために、単分子蛍光観察を行った。
①p53が標的配列へ結合する効率を計測し、“正確さ”を定量化した。p53の標的配列を含むDNAを作製し、基板上に固定化した。その後、蛍光色素修飾したp53が標的配列にたどり着いた時に、p53が標的配列に結合できるかどうかを計測した。結合の精度を結合確率と定義すると、これまで100%の結合確率で結合できると考えられていた。しかし、実際に計測したところ、結合に失敗することが多く、p53の結合確率は10%程度であることが明らかとなった。この成果は日本化学会や日本生物物理学会などで報告された。
②活性化変異体と不活性化変異体を作製し、単分子計測を用いて、p53がその変異や翻訳後修飾によりその機能を調整する仕組みを調べた。その結果、活性化変異体では結合確率が上がり、がん化変異体では結合確率が下がることが明らかとなった。一方、探索運動の拡散係数は変異により変化したものの、このように、結合確率と機能が相関していることから、p53の標的配列への結合確率が主に機能を制御していることが明らかになった。一方、探索運動の拡散係数は変異により変化したものの、機能との関連性はなかった。この成果は日本化学会や日本生物物理学会などで報告された。
③変性領域の長さを変えたp53変異体の単分子観察により、変性領域の長さがDNA探索に与える影響を調べた。2倍の変性領域を持つ変異体を作製し、“動き”を計測したところ、野生型とほぼ同程度の拡散運動をすることが明らかとなった。この結果は、変性領域の長さを多少変えたとしても、その機能への影響が少ないことを表している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１年目で研究計画の半分を行えたため、順調に研究を進められたと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の③に関して、変性領域の長さを３倍に変えたp53変異体を作製し、単分子観察を通して、変性領域の長さがDNA探索に与える影響を調べる。次に、p53のDNA探索時における障害物回避の仕組みを調べるため、DNA上の障害物を乗り越える様子を直接観察する方法を開発する。1年目の結果と統合し、p53がDNA上の標的配列を探索する仕組みを明らかにする。
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[Presentation] Target Search Process of A Tumor Suppressor p53 Revealed by Single-Molecule Fluorescence Microscopy2014
Author(s)
Murata A., Itoh, Y., Kashima, R., Tokino, T., Takahashi, S., Kamagata, K.
Organizer
The 16th international p53 workshop
Place of Presentation
Stockholm, Sweden
Year and Date
2014-06-15 – 2014-06-19
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