2015 Fiscal Year Annual Research Report
ABC輸送体のATP加水分解と基質輸送共役効率化のカギとなる残基の同定
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26840048
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山口 知宏 京都大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (80346791)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / ABCトランスポーター / X線結晶構造解析 / 基質輸送 / ATP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高等生物由来のABCトランスポーターは、ATP加水分解酵素（ATPase）反応と基質輸送の共役を調節する高度なメカニズムが存在すると予測される。申請者は、この共役特性を有するCmABCB1の内向型結晶構造を決定し、立体構造から予測された基質輸送経路上のGln残基をAlaに置換した変異がATPase活性と基質輸送の共役を消失させることを見出していた。
当研究期間の初年度は、当該Gln残基をAla以外のアミノ酸に置換したCmABCB1変異体を作成して生化学解析を行い、共役調節には当該残基の側鎖の適切な長さが重要であることを明らかにした。さらに、当該残基と基質の相互作用の有無を明らかにするために、基質アナログと共有結合を形成するCysの導入を行った。その結果、当該残基の近傍にCysを導入した変異体が、マレイミド基を付加したローダミンのアナログと共有結合を形成して安定な複合体を形成することを見出し、この複合体試料を用いて結晶化に成功した。
本年度は、この結晶を用いてX線結晶構造解析を行い、基質アナログと推定される新たな電子密度が観測できた。立体構造におけるこの電子密度の位置から、基質は当該残基と相互作用していないと考えられた。また、当該Gln残基のAlaへの改変による立体構造への影響を調べるために、前年度に引き続いてこの変異体の結晶化を試みた。構造解析に適した結晶が得られなかったため、ATPの非加水分解性アナログを用いてX線結晶解析により決定した外向型構造に基づいて、当該残基と相互作用する残基を探索した。その結果、当該残基は基質輸送経路をはさんで反対側にあるAla残基とファンデルワールス相互作用を形成することを見出した。前年度の生化学解析の結果と合わせて考えると、当該Gln残基はこのAla残基と相互作用することで、基質輸送経路の形状変化を調節している可能性が示唆された。
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[Presentation] Serial Femtosecond Crystallography of ABC Transporter2016
Author(s)
Oyama Ryo, Pan Dongqing, Nakatsu Toru, Sato Tomomi, Yamaguchi Tomohiro, Kodan Atsushi, Ueda Kazumitsu, Iwata So, Kato Hiroaki
Organizer
6th Special Meeting, ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases
Place of Presentation
Hotel Grauer Bar (Innsbruck, Austria)
Year and Date
2016-03-05 – 2016-03-11
Int'l Joint Research
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