2014 Fiscal Year Research-status Report
Gタンパク質共役型受容体のヘテロ多量体配置転換の解析
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26840055
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
柳川 正隆 独立行政法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 基礎科学特別研究員 (70609792)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | GPCR / 代謝型グルタミン酸受容体 / セロトニン受容体 / FRET / 1分子イメージング / 統合失調症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、様々なGタンパク質共役型受容体(GPCR)が二量体・多量体を形成して高度な機能調節を行う事例が報告され、新たな創薬のターゲットとして注目されている。しかし、GPCRの多量体化による機能調節の分子メカニズムは明らかでない。本研究では、GPCRが生細胞中でどの程度のサイズの多量体を安定に形成するのか、また、多量体のどのような構造変化が機能調節につながるのかを解明することを目的とする。具体的には、統合失調症との関わりが報告される代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)とセロトニン受容体(5HTR)のヘテロ多量体をモデルとして、培養細胞に蛍光標識した両受容体を共発現し、様々なリガンド条件下で全反射蛍光顕微鏡による1分子計測・FRET解析を行う。
平成26年度は、交付申請書に基づき、mGluRと5HTRのヘテロ多量体の構造変化を検出するFRETセンサーの構築を行った。mGluRと5HTRの細胞質ループ領域に対してGFP/Halo/SNAP/CLIP-tagを挿入した変異体を作製し、様々な組み合わせで共発現・蛍光標識を検討した。その結果、mGluR/5HTRにCLIP-tag/SNAP-tagをそれぞれ融合した共発現膜試料について、リガンド依存的なFRET効率の変化を検出できるプローブの作成に成功した。平成27年度は、本プローブを用いて様々なリガンド存在下で1分子FRET計測を行う。
生細胞におけるmGluRと5HTRの2色同時1分子計測については、N/C末端を蛍光標識した5HTRの膜局在が乏しく、良好な観察結果が得られていない。平成27年度は、5HTRのN末端に対するシグナルペプチドの挿入を検討し、膜局在の改善を図りたい。一方、mGluRのホモ多量体については1分子動態解析に成功し、拡散状態・多量体サイズと活性の間に相関が見られるなど、一定の結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は、交付申請書に記載した研究計画のうち主要な部分を占める、mGluRと5HTRのヘテロ多量体の構造変化を検出するFRETプローブの構築に成功しており、交付申請書の予定通り平成27年度の研究計画を遂行できる。
5HTRの膜局在がN末端・C末端標識に関わらず極めて低かったことは、予想外な結果であった。しかし、生細胞においてmGluRの多量体サイズ・拡散状態がGタンパク質活性化能と相関して変化するという論文発表に足るデータが得られており、十分な進展があったと考える(投稿準備中)。
以上の進捗状況を鑑み、研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
<１分子FRET計測によるmGluR/5HTRのヘテロ多量体の刺激依存的な構造変化の推定>
平成27年度は、平成26年度に構築したFRETセンサーを用いて、様々なリガンド条件下で１分子FRET計測を行う。１分子レベルの解析を行うことで、バルクの解析では区別できない複数の構造状態のアンサンブルから、異なる状態を区別することができると期待される。まず、バルクのFRET解析に用いた膜画分をガラス基板上に吸着させ、全反射蛍光顕微鏡を用いて2色同時計測を行う。同一輝点のドナー・アクセプタの蛍光強度を比較することで各輝点のFRET効率を算出する。FRET効率の分布を解析することで多量体配置の状態数を推定し、各リガンド刺激によりどの状態が安定化されるかを解析する。
<生化学的解析によるmGluR/5HTRヘテロ多量体の各構造状態と機能の対応関係の推定>
野生型mGluR/5HTRの共発現膜画分を用いて、FRET解析と同リガンド条件下でGタンパク質活性化能を測定する。この結果とFRET効率の分布と比較することで、多量体の構造と機能(Gi/Gqの活性化能のバランス)がどのように対応しているのかを推定する。Gタンパク質活性化能は、[35S]GTPγS結合実験により測定する。以上の解析により、FRET効率と機能の間に対応関係がつけば、FRET効率を指標にした１分子計測による薬効評価が可能になると期待される。
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| Causes of Carryover |
当初、1分子FRET計測のためにレーザーを購入することを検討していたが、mGluR/5HTRのプローブの構築が完了するまでは波長を確定できず、平成27年度に購入を繰り越すことにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成26年度、構築に成功したFRETプローブは、mGluR・5HTRをCLIP-TMR・SNAP-647でそれぞれ標識したものである。したがって、それぞれの蛍光色素に適したレーザー購入に繰越金および平成27年度請求分の助成金の一部を充てたい。
残る助成金は、遺伝子操作試薬・細胞培養用培地・蛍光染色試薬・顕微鏡観察用光学部品・生化学的解析に用いる試薬など消耗品の購入を計画している。
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