2014 Fiscal Year Research-status Report
HTLV-1 Taxによるユビキチン修飾を介したIKK複合体活性化機構の解析
| Project/Area Number |
26840062
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
柴田 佑里 東京大学, 医科学研究所, 助教 (20722573)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | HTLV-1 Tax / ユビキチン修飾 / NF-κB |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトレトロウイルスHTLV-1にコードされるTaxタンパク質は恒常的なIKK複合体活性化を誘導することで細胞不死化・がん化を引き起こすため、その活性化機構の解析は重要である。これまでに、TaxはIKK複合体活性化にユビキチン修飾系を必要とすることが明らかとなっているが、その過程に関与するユビキチン修飾系の酵素、形成されたポリユビキチン鎖がIKK複合体活性化を誘導するメカニズムの全容は明らかになっていない。
はじめに、活性中心に変異を導入したユビキチン結合酵素 (E2) のドミナントネガティブ変異体を用いて、Tax誘導性のIKK複合体活性化に必要なE2の同定を行った。その結果、作製した12個のE2変異体のうち、Ubc13の変異体によりTax誘導性のIKK複合体活性化が抑制された。次に、in vitroにおけるユビキチン化反応系を用いてTaxがユビキチンリガーゼ (E3) として機能しうるかどうか検討を行ったが、TaxはE3活性を有していなかった。そこで、Tax-IKK複合体に結合するタンパク質を質量分析により網羅的に解析し、その中からE3の候補を同定しようと試みた。その結果、一つのE3候補を得ることができた。さらに、Tax誘導性のIKK複合体活性化の際にポリユビキチン化される基質の同定を試みた。IsoT処理によってTax誘導性のIκBαのリン酸化が減弱したことから、unanchoredのポリユビキチン鎖がこの経路に必要であることが明らかとなった。また、ユビキチンのリシン残基をアルギニン残基に置換したユビキチン変異体を用いて、Tax誘導性のIKK複合体活性化に必要なユビキチンの型の同定を行った。K27RおよびK63Rユビキチン変異体を添加した際にTaxによるIκBαのリン酸化が減弱したことから、この経路には27型および63型のポリユビキチン鎖が必要であることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はTax誘導性のIKK複合体活性化に必要なE2、E3、ポリユビキチン鎖の基質と型の同定を目的として研究を遂行した。その結果、E2に関してはUbc13がTax誘導性のIKK複合体活性化に必要であることを見いだした。さらに、この経路ではunanchoredのポリユビキチン鎖がIKK複合体活性化に関与すること、IKK複合体活性化に必要なポリユビキチン鎖は27型と63型であることを明らかにした。E3に関しては、当初TaxがE3として機能すると仮定していたが、TaxはE3活性を有していなかった。そのため、現在、質量分析により同定したE3候補について解析を行っている。また、E3候補以外にも新規Tax-IKK複合体結合タンパク質をいくつか同定しており、今後これら新規結合分子がTax誘導性のIKK複合体活性化に関与するかどうか検討を行う予定である。上述のように、E3の解析に関しては少々遅れているものの当初の予定通りに計画を遂行しているため、おおむね順調に進展していると評価した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
RNAi法を用いてE3候補の発現抑制を行い、同定したE3候補がTax誘導性のIKK複合体活性化に関与するかどうか検討を行う予定である。その後、組換えTax、精製したIKK複合体、組換えIκBα、E1、Ubc13/Uev1aと同定したE3を用いてin vitroにおける再構築実験を行う。同定したE3の機能解析に関しては、in vitroのポリユビキチン化反応を行い、同定したE3が何型のポリユビキチン鎖を形成するのか検討する。また、実際にTax-IKK複合体に含まれるポリユビキチン鎖の型を質量分析により解析する。さらに、Tax依存的に誘導されたポリユビキチン鎖がIKK複合体活性化にどのように寄与するのか、IKK複合体の多量体化に注目をして実験を行う。質量分析で同定した新規Tax-IKK複合体結合タンパク質に関しては、RNAi法を用いて発現抑制を行い、これら分子がTax誘導性のIKK複合体活性化に関与するかどうか検討を行う予定である。
|
| Causes of Carryover |
Tax誘導性のIKK複合体活性化に必要なユビキチンリガーゼの同定に関して、当初はTaxがユビキチンリガーゼであると仮定していたが、他のユビキチンリガーゼが必要であることが明らかとなった。そのため、次年度にユビキチンリガーゼ同定を行うための試薬等を購入する必要ができたため、次年度使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に再度質量分析を行って、Tax-IKK複合体結合タンパク質の同定を行う。また、E3候補の発現抑制のためのsiRNAなど発現抑制実験に必要な試薬類を購入する。
|
