2015 Fiscal Year Annual Research Report
TALEN法によるオオムギの標的遺伝子への変異挿入
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26850004
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
久野 裕 岡山大学, その他部局等, 助教 (70415454)
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2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 植物分子育種 / オオムギ / 形質転換 / ゲノム編集 / TALEN |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【背景と目的】カルス特異的プロモーターは、カルスでは働くが再分化後の植物ではほとんど活性が無いと考えられるので、ゲノム編集における人工制限酵素（TALEN）遺伝子への適用が期待できる。本年度は、オオムギゲノム編集での利用を目的として、オオムギのカルス特異的プロモーターの単離および一過的発現解析を行った。
【材料と方法】オオムギ品種「Golden Promise」と「はるな二条」の未熟胚からカルスを誘導し、増殖培地に継代したカルス（CI）と再分化を誘導したカルス（RG）を採取した。それぞれのカルスからRNAを抽出し、マイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。得られた情報を基に、CIでシグナルが強かったプローブを抽出し、その中からCI/RGの比率が5倍以上のものを選抜した。選抜したプローブに付随するゲノム情報からプロモーター領域を推定し、PCRにて1,500 bp程度のDNA断片をクローニングした。得られた領域は、EGFP発現ベクターのプロモーター部分に組み込み、アグロバクテリウム法で「Golden Promise」に導入した。
【結果】マイクロアレイの結果、CIでシグナルが強い20のプローブを抽出し、そのうちCI/RGの比率が平均5倍以上の6つのプローブを選抜した。アノテーションが明確な4つのプローブについて、プロモーター領域のレポーターアッセイを行った。その結果、4つ全てのプロモーターにおいてカルスでのEGFP発現が観察された。このことから、これらのプロモーターがカルスで活性を持つことが確認できた。ハイグロマイシンで選抜後、耐性カルスの蛍光量を測定したところ、2つのプロモーターでEGFP高発現が確認できた。
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