2014 Fiscal Year Research-status Report
プロトカテク酸脱炭酸酵素の活性向上機構の解明と植物バイオマスからのムコン酸生産
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26850041
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
園木 和典 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (20502264)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | プロトカテク酸脱炭酸酵素 / ムコン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、脱炭酸活性が向上したプロトカテク酸脱炭酸酵素（Pdc）について活性向上のメカニズムを明らかにし、高活性化Pdcと多様なリグニン系芳香族化合物を分解できるP. putida KT2440株の代謝系を利用して、リグニン系芳香族化合物を原料としたccMA生産に資する微生物株を育種するために、（1）脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価と、（2）高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価について、H26年度の計画を実施した。
（1）脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価：Pdc活性を向上させる遺伝子領域を検討した結果、Phenolic acid decarboxylase（BsdBCD）を構成する3つのサブユニットのうちBsdBと相同性を有する遺伝子（kpdB；4-hydroxybenzoate decarboxylase (KpdBCD) のサブユニットをコードする遺伝子）がPdc活性の向上に必須の領域であり、PdcとKpdBを発現する組換え大腸菌由来の粗酵素液中のPdc活性は、10倍以上向上することを明らかにした。粗酵素液中のPdc活性の最適pHは5.5、最適温度は35℃であった。この高活性化Pdcを生産する組換え大腸菌の粗酵素液からPdcの精製を試みたが、これまでに報告されてきたPdc同様、粗精製の段階でPdc活性の顕著な失活が確認された。また、DEAEクロマトグラフィーにおいてPdcとKpdBは異なる画分に分画され（異なる塩濃度で溶出され）たことから、PdcとKpdBは複合体を形成しておらず、他のメカニズムによってPdc活性が向上していることが示唆された。
（2）高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価：P. putida KT2440株のニトロソグアニジン変異株の中から、PAを代謝できない変異株を選択し、さらにcatBを破壊して、PAだけでなくccMAも代謝できない変異株を作出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価
精製過程においてPdc活性の急激な失活が観察されたので、当初計画の対応通り、粗酵素液を用いて高活性化Pdcの評価を達成した。しかし十分な活性を保持した状態で高活性化Pdcの精製には至らなかったので、構造解析は保留した。
(2)高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価
当初計画の通り、PAとccMAを代謝できない変異株の作出を達成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価
当初計画通り、引き続き高活性化Pdc反応の諸性質解析を進める。特に精製酵素を調製して反応機構を解明を進める。26年度の取り組みにおいて、高活性化Pdcを発現する大腸菌粗酵素液は、4℃で24時間経過しても80％以上のPdc活性を保持していることを見出した。従来の報告からは精製過程におけるPdc活性の失活は酵素の不安定性によるものと考えられたが、検討の結果から精製過程の失活はPdcの不安定性に起因するものではなく、補因子の遊離によるものと考えることができる。そこで遺伝子工学的手法を用いて精製Pdc、精製Kpdを調製し、これらが結合している補因子を明らかにすることを通してPdc反応のメカニズムを明らかにする。
(2)高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価
26年度に作出したPAとccMAを代謝できない変異株を宿主として、高活性化Pdcを発現する組換え体を作出し、リグニン系芳香族化合物を原料としたccMA生産能力を評価する。
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| Causes of Carryover |
生じた次年度使用額は、共同研究のため米国に長期渡航したため、当初予定していた物品の購入を見送ったものである。この渡航による研究計画への影響はわずかであり、ほぼ順調に研究計画は進行している。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
未使用分の助成金は当該年度の助成金と合わせて、遅れている部分の研究計画を加速するための物品費（試薬；遺伝子操作用、酵素機能評価用）および学内共同利用施設利用料に使用する。
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Research Products
(2 results)
