逆転写反応における非特異的増幅の抑制

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26850050
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 福井 健二 大阪医科大学, 医学部, 助教 (00466038)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ミスマッチ認識タンパク質 / 高度好熱菌 / PCR / 逆転写反応

Outline of Annual Research Achievements

これまでに, プライマーの誤対合により生じたミスマッチを, 高度好熱菌由来ミスマッチ修復系タンパク質 MutS に認識させることで PCR の非特異的増幅を抑制できることを示した。今年度, 新たに発見した高度好熱菌由来ミスマッチ認識タンパク質にも同様の効果がある事を確かめた。この新規ミスマッチ認識タンパク質は, MutS と比較してより大きいミスマッチまで認識できるという特徴があった。さらに、MutS と異なり、DNA/DNA から成るミスマッチだけでなく、DNA/RNA ハイブリッドから成るミスマッチにも結合できることを確認した。このことは、この新規ミスマッチ認識タンパク質が逆転写反応における非特異的増幅の抑制に応用できる可能性を示唆するものである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度における目標であった「DNA/RNA ミスマッチ認識タンパク質の同定」を達成した。このタンパク質の再現性の良い調製方法を確立し, 基質特異性もほぼ明らかにできた。さらに, このタンパク質の核酸結合能に大きな影響を与える低分子についても同定した。

Strategy for Future Research Activity

今後は, 新規 DNA/RNA ミスマッチ認識タンパク質によって逆転写反応における非特異的増幅を抑制できるかを確かめる。まず, 単純化した実験系を用いて, このタンパク質が機能する条件を調べる。次に, より実際の実験系, 例えば mRNA, miRNA や RNA ウイルスの検出・定量における効果を確かめる。

Causes of Carryover

新たに同定したタンパク質について, 当該年度中に結晶化に成功した場合には X 線結晶構造解析を行う予定であったが, 測定に供与できる品質の結晶が得られず, この解析については次年度に持ち越す事とした。そのため, 測定の必要経費を次年度に繰り越した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

新規ミスマッチ認識タンパク質の X 線結晶構造解析に必要な経費として使用する。具体的には, タンパク質結晶の品質を改善するために用いる試薬類, 結晶をすくうためのループ等の消耗品, 測定を行う SPring-8 までの旅費に充てる予定である。