植物の細胞壁構築に関与するキチナーゼ様タンパク質CTLの構造と機能

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26850066
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 大沼 貴之 近畿大学, 農学部, 准教授 (60446482)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: キチナーゼ様タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、シロイヌナズナキチナーゼ様タンパク質（Chitinase Like Protein）AtCTL1、AtCTL2およびイネのOsCTL1と結合する植物細胞壁由来の糖鎖分子を同定すること、またCTLタンパク質によるそれら糖鎖の認識機構を明らかにすることを目的にしている。前年度の実験結果を踏まえ、今年度はCTLタンパク質を構成するN末端シグナル配列、膜貫通ドメイン、ファミリーGH19キチナーゼ様ドメインとC末端領域の内、ファミリーGH19キチナーゼ様ドメインのみの組換え型タンパク質を得ることを目的に実験を行った。大腸菌－T7プロモーターおよびrhaPBADプロモーター系発現ベクターを用いた発現システムによって、正しい立体構造を保持したCTLタンパク質の生産を試みた。しかし、可溶性タンパク質としてCTLタンパク質が発現されることを期待して、様々な大腸菌株を発現用宿主として用い、低温誘導によりタンパク質を発現させたが、実験を行った全ての条件下でCTLタンパク質は沈殿画分に発現され、同タンパク質の精製、機能解析を行うことはできなかった。機能を保持した組換え型CTLタンパク質を得るために、SUMO(Small Ubiquitin-like MOdifier)タグおよびGST(Glutathione S-Transferase)タグとの融合タンパク質として発現させることを試みた。その結果、AtCTL1のGH19キチナーゼ様ドメインを可溶性タンパク質として発現させることに成功した。また、GH19キチナーゼ様ドメインはプロテアーゼ処理によるタグ切断後も可溶性を維持した。タグ切断後の同ドメインは、クロマトグラフィーに供することによりSDS-PAGEで均一なまでに精製することができた。