2014 Fiscal Year Research-status Report
Ｘ線結晶構造解析によるイネ由来生理活性タンパク質の機能発現に関わる分子機構の解明
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26850077
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
落合 秋人 新潟大学, 自然科学系, 助教 (40588266)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | α-アミラーゼ / ディフェンシン / イネ / 生理活性 / 免疫亢進 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【研究実績の概要】
研究代表者は、イネ由来のα-アミラーゼ(AmyI-1)が細菌内毒素(LPSやLTA)と結合し、抗炎症などのヒト生体防御機能に関与することを過去に見出している。また、熱安定性が極めて高く、抗菌活性などの多機能性が知られているディフェンシン様のタンパク質をイネゲノムから見出した。本年度は、AmyI-1の細菌内毒素に対する分子認識機構を解明するため、内毒素とAmyI-1とのX線結晶構造解析を進めた。また、イネディフェンシンの生理学的・構造生物学的な解析を行うため、2種類のイネディフェンシンの組換えタンパク質を調製した。具体的な研究成果を以下に示す。
【AmyI-1/LPS複合体およびAmyI-1/LTA複合体のＸ線結晶構造解析】AmyI-1の結晶を2.5 mg/mlの内毒素(LPSもしくはLTA)を含む結晶化溶液に移して浸透させることにより、AmyI-1と内毒素との複合体結晶を調製した。決定したAmyI-1/LTA複合体において、LTAのN-アセチルグルコサミン部がAmyI-1の活性中心に埋め込まれるように結合していた。また、AmyI-1の糖鎖結合部位にもLTA由来の電子密度マップが確認された。AmyI-1/LPS複合体においては、糖鎖結合部位にのみLPS由来の電子密度マップが確認された。
【イネディフェンシンの組換えタンパク質の調製】2種類のイネディフェンシンについて、大腸菌発現系を使用して組換えタンパク質を調製した。発現させた組換えタンパク質は2段階のクロマトグラフィーによって精製した。最終的に、18 Lの大腸菌培養液から2~3 mgの精製タンパク質を得た。それぞれのディフェンシンのヒト病原性真菌Candida albicansに対する抗真菌活性を測定したところ、完全な増殖抑制を示す最小発育阻止濃度(MIC)はそれぞれ約5 μMおよび60 μMであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載した当該年度の研究計画は、[1]-1 AmyI-1/LPS複合体およびAmyI-1/LTA複合体のＸ線結晶構造解析、[2]-1 イネディフェンシンの組換えタンパク質の調製、[2]-2 イネ種子中におけるイネディフェンシンの発現量と発現分布特性の解析である。[1]-1に関して、予定通りそれぞれの複合体の立体構造を解明し、AmyI-1における内毒素の結合様式を明らかにした。一方、[2]-1および[2]-2に関して、6種類中2種類のイネディフェンシンについて組換えタンパク質の調製法を確立し、その機能解析を行った。他の4種類のディフェンシンについては組換えタンパク質の調製中であるが、先行の2種類のディフェンシンにおいて調製法を確立したため、早期達成が見込まれる。調整が完了した2種類のディフェンシンについては、次年度分の研究計画を前倒しして機能解析を進めており、一部の研究成果については当初の計画以上の進展と言える。イネディフェンシンに関する成果の一部は、特許出願を目指している。以上、研究計画のとおり概ね順調に進展しており、その一部は当初の計画以上の進展をみせている。
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| Strategy for Future Research Activity |
交付申請書に記載の通り、研究計画はほぼ順調に進展している。そこで、まず研究計画[1]-2に従って、決定した複合体結晶の立体構造情報に基づいてAmyI-1の特定のアミノ残基に部位特異的変異を導入し、生体分子間相互作用解析により内毒素との結合に関わるアミノ酸残基を明らかにする。本年度は内毒素由来と推定される電子密度マップの確認された糖鎖結合部位周辺のアミノ酸残基について変異解析を行う。さらに、前年度に続いて6種のイネディフェンシンの組換えタンパク質の調製を進め、研究計画[2]-3に従って様々なヒト病原菌やイネ病原菌に対する抗菌スペクトルを解析する予定である。また、pH、温度の変化時における抗菌活性の低下率を測定することによって、外的要因に対する安定性を評価し、その特性を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
3月末の学会参加における旅費の支払いが4月に行われるため、帳簿上繰り越されているが既に使用済みである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越額は、全て3月末の学会参加における旅費の支払いに充当済みである。
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