リン酸化ニューロフィラメント重鎖血中濃度を用いた脊髄損傷の新規診断・治療法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26850193
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 藤原 玲奈 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (60456176)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 脊髄損傷 / バイオマーカー / リン酸化ニューロフィラメント重鎖

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、術後に積極的なリハビリテーションを行った場合、血中pNF-H濃度が上昇するかを確認したが、リハビリテーションを開始後、1か月以上経過しても血中pNF-Hは検出されなかった。このことから、手術により圧迫が十分解除されていれば、積極的なリハビリテーションを行っても、脊髄への新たな損傷原因にはならないことが示唆された。また、他の中枢神経系疾患においても発症後の血中pNF-H測定を行ったが、外側型椎間板ヘルニアのような、末梢神経に対する損傷が生じている場合、臨床症状は軽度であっても、血中pNF-Hが高くなる傾向があり、血中pNF-H濃度からの重症度判定には損傷部位の解剖学的位置を含めた検討が必要であり、血中濃度の理解にはMRIなどの画像診断も重要であることが示唆された。以上の結果から、pNF-Hは神経損傷あるいは変性疾患の病態をモニタリング可能な補助的検査として有用であると考え、犬pNF-HのELISA測定系を独自に開発することとした。犬NF-Hタンパクの二次構造情報をもとに、特異的抗原認識部位となりうる領域を選定し、その領域の抗原ペプチドを作製した。ウサギおよびニワトリで免疫を行ったのち、現在ウサギからIgG抗体、卵黄からIgY抗体を得ている。それぞれELISAで十分な力価が確認できており、本年度はサンドイッチELISAによる血清中pNF-H測定を確認し、臨床例での利用を試みる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度に血中pNF-H濃度上昇の臨床的意義を明らかにし、計画以上の進捗を得られたが、市販のELISA kitは高価なため、サンプルが一定量に達しないと、経済的な理由から測定が困難であった。本年度は本研究における経済的な支障を取り除くため、ELISAの測定系を自作することとした。現在、ウサギおよびニワトリでの免疫が終了し、本年度はELISAによる迅速な犬pNF-H測定系を作製する。測定の信頼性が高ければ即時に臨床応用できる体制が整うと予想している。

Strategy for Future Research Activity

本年度はELISAの測定系を確立し、信頼性を確認した後、実際にpNF-Hの迅速測定法をさらに開発し、pNF-H測定が日常的な臨床において活用されることを目指す。また、脊髄損傷以外にも様々な神経疾患の他、整形外科学的疾患においてもpNF-H測定を行い、血中pNF-H濃度上昇が神経疾患特異的であるかどうかを確認する。

Causes of Carryover

実験に用いた消耗品は前年度までに購入した物品で賄えた。また、本年度はELISA測定系の確立のため、犬ニューロフィラメント重鎖ペプチド抗原を作製し、ウサギおよびニワトリでの免疫を行った。現在、ペプチド抗原に対する精度の高い抗体（血清および粗IgG）を得ているが、免疫動物の作製には時間を要するため、本年度は抗体作成までで終了している。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度予算で作製された抗体の精度を既知の犬pNF-Hに対して確認する。確認された場合、さらに抗体を精製し、確度を上げる予定である。精度の高いELISA系が確立されれば、さらに系を短縮化し、日常的な診療業務において迅速にpNF-H測定が可能な測定系を確立する予定である。

Research Products

• [Presentation] Assessment of serum phosphorylated neurofilament subunit NF-H and glial fibrillary acidic protein as biomarkers for evaluating the severity of spinal cord injury after thoracolumbar intervertebral disc herniation in dogs (2015)
  • Author(s): Naoki Fujita, Reina Fujiwara, Fumito Mikashima, Ryu Youngjae, Onishi Yumi, Hinako Yamazoe, Motoji Morozumi, Hidetaka Nishida, Hiroshi Tanaka, Masanari Nakyama, Kentaro Hayakawa, Toru Ogata, Rhohei Nishimura
  • Organizer: American College of Veterinary Surgeons Surgery Summit
  • Place of Presentation: Nashville, TN, USA
  • Year and Date: 2015-10-22 – 2015-10-24
  • Int'l Joint Research