感染牛の初乳中抗体を活用した牛白血病ウイルス感染予防薬の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26850203
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 小西 美佐子 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究所ウイルス・疫学研究領域, 主任研究員 (20355168)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 牛白血病ウイルス / 初乳中抗体 / 家畜衛生 / 感染防御

Outline of Annual Research Achievements

1. 泌乳期間による乳汁中抗体力価の変動調査のための採材
分娩から乾乳までの泌乳期間における乳汁中抗BLV抗体量の経時的変動を調査するため、BLV自然感染牛6頭および非感染牛4頭から乳汁および血液を定期的に採材した。乳汁は出産1～7日後までの毎日と2週間後、さらに1ヶ月後から乾乳までは1ヶ月ごとに１回/日採材し、血液（EDTA血および血清）は分娩1ヶ月前から乾乳まで、1ヶ月ごとに採材することとした。採材は現在も継続中である。
2. 乳汁からの効率的な抗BLV抗体精製法の確立
1.で得られた乳汁から抗BLV抗体を精製する方法を確立するため、条件検討を行った。サンプルには、原乳から遠心処理によって脂肪層を分離・除去した乳清を用いた。乳清をさらに超遠心処理して得られた上清から、硫酸アンモニウム沈殿法により蛋白質を回収した。市販のプロテインG固定化カラムを用いて得られた沈査からIgGを精製した。精製したIgGをSDS-PAGEで確認したところ、IgG量は分娩後日数の経過とともに低下していく傾向が認められた。
3. 乳汁中抗体によるシンシチウム形成抑制能の評価法確立
乳汁中抗体によるBLV感染防御能をin vitroで評価する方法を確立するため、シンシチウム形成抑制試験法の条件検討を行った。その結果、乳中抗体の細胞傷害活性は補体依存性であり、試験には市販のウサギ補体を加える必要があることが判明した。確立した試験法では、BLV持続感染細胞と乳清を補体存在下で反応させた後、BLV感受性細胞を加え、2日後に判定する。判定は細胞をギムザ染色し、抗体無添加の陰性対照に比べ、形成されたシンシチウムが半分以下となっていた場合、抗体陽性とした。一部の感染牛の超遠心処理後の乳清を用いて本法を実施したところ、抗体力価は分娩後日数の経過とともに低下することが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、乳汁中抗体によるシンシチウム形成抑制能およびBLV感染抑制能の評価法確立を計画していたが、前者の試験法確立において、原乳を粗遠心した乳清を用いると、乳汁中成分によって細胞が傷害を受けることが判明した。そこで計画を変更し、H27年度に実施予定であった初乳からのIgG精製法確立のための条件検討を本年度実施した。その結果、乳汁からのIgG精製条件が確定し、またシンシチウム形成抑制試験法には超遠心後の乳清が適していることが判明した。したがって、本研究はおおむね順調に進展していると考える。H27年度にBLVに特異的なIgGのみを精製する方法を検討する。

Strategy for Future Research Activity

H27年度は、乳汁中抗体によるBLV感染抑制能の評価法確立を試みる。具体的には、BLV持続感染細胞の感染能は維持したまま、細胞の自己増殖能を消失させるためのマイトマイシンC処理条件を検討する。また、乳汁から精製したIgGの濃度を測定するとともに、抗BLV抗体のみを分離・精製する方法を検討する。具体的には、BLVのエンベロープ抗原（gp51）を結合させた市販のリガンド固定化アフィニティーカラムを用いる計画である。これに先立ち、BLV持続感染細胞の培養上清からgp51を濃縮・精製する。また、定期的に採材したサンプルを用いた抗体力価測定も継続する。乳汁中抗BLV抗体の標的蛋白質の解明および同抗体のBLV感染防御能の検証は、H28年度に実施する予定である。