2015 Fiscal Year Research-status Report
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26850215
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
金児 雄 弘前大学, 農学生命科学部, 助教 (90633610)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 体節特異性 / カイコ / ホルモン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫の蛹変態は、幼若ホルモンが消失することで引き金が引かれる。その後エクダイソンをはじめとするホルモンに対して各組織がそれぞれ異なる応答（再構成、新生、細胞死など）をすることで、個体の蛹への変態が完了する。しかし開放血管系である昆虫において、体液中に均一に拡散しているホルモンが、どのような機構で異なる組織に異なる作用を引き起こすのかは不明である。このホルモンによる組織特異的な変態誘導機構を分子レベルで解明することが本申請研究の目的である。そこで各体節に存在し、かつ蛹変態時に体節特異的に細胞死が誘導されるベルソン氏腺を用いてこの命題に取り組んだ。
まず体節特異的に発現する遺伝子を調べるために、既に行っていたマイクロアレイに加えて、細胞死を起こす体節と起こさない体節との間でRNAシークエンスを行い、候補遺伝子の探索を行った。現在得られた候補遺伝子のうち約４０遺伝子についてreal time PCRによって体節特異性を確認した結果、すべての遺伝子において体節特異的な発現が確認できた。また体節特異的なJHへの応答により細胞死が誘導されると考えられることから、その受容体の体節特異性の確認およびRNAiによる細胞死への影響を検討した。体節特異的な受容体の発現は見られなかったが、受容体が無いとJHによる細胞死抑制効果は見られなくなったことから、受容体を介して、それより下流のシグナル伝達において体節特異性が生み出されることが明らかになった。加えて細胞死の機構を解析するために、caspase-3の関与およびautophagyの関与を免疫組織化学的手法で確認したところ、caspase-3の関与が明らかになった。そこで既知の細胞死関連遺伝子について発現解析を行った結果、まずautophagyによる自己貪食が進み、その後caspae-3の活性化を伴うアポトーシスが起こることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２７年度は、主にJH受容体であるMet遺伝子の体節特異的な細胞死への関与の解明を挙げており、このことについては発現解析およびRNAiによる遺伝子のノックダウンにより証明することができた。一方で、遺伝子間の相互作用についてもRNAi後の発現状況を解析することで、ある程度進めることができている。また細胞死の実行段階での分子実体も明らかになりつつあり、計画が順調に進行していることを物語っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）体節特異的な細胞死誘導遺伝子間の相互作用の解明
候補遺伝子の絞り込みを引き続き行うと共に、遺伝子間の相互作用の解明により最終的に全ての情報から体節特異的細胞死に関わるシグナル系を構築する。すでにある程度のアウトラインは解明しつつあるので、さらに詳しい検証を行っていく。
２）体節特異性およびJH応答性に関与する遺伝子の上流配列の解析
体節特異的な制御領域を探索するため、これまで得られた候補遺伝子群の上流配列を比較し、保存性の高い領域の探索を行う。カイコは既にゲノム情報の整理が十分に行われており、上流配列の探索は円滑に進むと期待できる。またベルソン氏腺を用いるアッセイは、培養細胞を用いたレポーターアッセイとは異なり、解析したい組織で直接行うため、得られる情報は信頼性が高い。そこで上流配列の比較により保存領域を見出し、その配列の直下にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を組み込むことで、ベルソン氏腺の遺伝子導入系を用いたレポーターアッセイを行う。体節特異性については、細胞死を起こす体節および起こさない体節のベルソン氏腺の両方でアッセイを行うことで確認する。一方JH応答性については、培養系でJHを添加し応答を確認する。また共通配列が見られなかった場合、体節特異性及びJH応答性が高かった遺伝子の上流配列に対してレポーターアッセイを行い、応答配列の絞り込みを行う。応答配列を比較することで、ホルモンによる体節特異性の分子機構にさらに迫る。
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