2014 Fiscal Year Research-status Report
新規分子蛍光センサーを用いた昆虫ホルモン運搬機構の解明
| Project/Area Number |
26850216
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
|---|
Principal Investigator |
菊田 真吾 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (90718686)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | FRET / バイオセンサー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、FRETの原理に基づく昆虫ホルモンバイオセンサーの開発を行った。対象とする昆虫ホルモン及びリガンド結合タンパクは特許出願に関わるため、具体的な名称は伏せる。リガンド結合タンパクに二種類の異なる蛍光タンパクを遺伝子工学的手法により付加した。アミノ酸数、種類を変えた様々なバイオセンサーバリアントを作製し、リガンド結合・乖離時における蛍光変化（FRET効率）を検証したところ、非常に大きな蛍光強度比が得られた。本センサーをヒト腎胎由来細胞HEK293Tに発現させた。まだFRETの誘起は確認していないが、当初の目的であった機能し得る細胞膜局在性型センサーの異所発現に成功した。併せて昆虫由来培養細胞に適用可能なセンサー発現ベクターも構築済みである。次年度は、研究計画に沿って細胞内に運搬されたホルモンを検知する解析を引き続き行う。昆虫生体内にセンサーを発現させ、生きたままの昆虫の外部から直接ホルモンを捉えることが本課題の最終目標の一つである。しかし、本センサーはリガンド結合時、非可逆的に蛍光変化を示すようにみえた。すなわちリガンドがセンサーに結合すると、乖離しづらい状態となるため、生体内の分子の動きを阻害する可能性が考えられる。研究課題遂行の少し回り道となるが、アミノ酸改変によりセンサーに可逆的に蛍光変化を引き起こさせることが重要であると考えた。また標的細胞近傍でホルモンがリガンド結合タンパクから乖離される原理の解明につながると考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞レベルにおけるFRET検出にはまだ課題が残されているものの、これまでにない高安定性、高感度ホルモン認識センサーの開発に成功したため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
種々の培養細胞にセンサーを一過発現させ、リガンド添加時における蛍光変化を捉える
リガンド結合乖離時に可逆的に機能するセンサーを開発する
|
| Causes of Carryover |
研究遂行内容を一部変更する必要があり、当初予定していた必要消耗品の購入を延長したため
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
消耗品（遺伝子工学用試薬及び細胞培養試薬）の購入に充てる
|
