2014 Fiscal Year Research-status Report
液胞型ATPaseサブユニット間相互作用による機能制御機構の解明
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26850234
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
河田 美幸 愛媛大学, 総合科学研究支援センター, 助教 (10454498)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | V-ATPase / ナトリウム輸送 / 腸球菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H26年度はNtpKリングとNtpCサブユニット間の相互作用部位の同定を目的とし、サプレッサー変異株の単離を中心に行った。Na+輸送能の無いV-ATPase活性消失型変異であるNtpK(E139D)変異を相補するサプレッサー変異は、イオン結合部位の構造変化以外に、イオン輸送とATP加水分解の共役(回転力の伝達) が変化した変異を含む可能性がある。ntpK(E139D)遺伝子への変異導入を行い、耐塩性を指標としてサプレッサー変異株の候補を単離した。E139Dを相補するサプレッサー変異の候補としてE50KとV138Iの2つの変異を得たため、現在これら変異型酵素の性質を解析中である。期待に反しE50K/E139D二重変異は完全なサプレッサー変異ではなかったが、E50K単一変異でV-ATPaseの活性が低下することが分かった。以上の内容に関して、第87回日本生化学会大会においてポスター発表を行った。E50残基はNtpKの細胞質側ループに存在し、NtpKリングとNtpCサブユニットとの境界面に位置すると考えられる。E50残基の他のアミノ酸への置換変異は、V1部分におけるATP加水分解がV0部分におけるイオン輸送(回転)に正常に連動しない変異(uncouplingあるいはloose coupling)体の獲得につながる可能性があるため、今後中心的に解析を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
サプレッサー変異株の単離を行い、候補変異株を複数得た。このうちE50残基はNtpKとNtpCとの接触面（NtpKの細胞質側ループ）に位置するアミノ酸残基であると考えられる。本変異は、V1部分におけるATP加水分解がV0部分におけるイオン輸送(回転)に正常に連動しない変異体である可能性があり、H27年度以降に進めるNtpK-NtpC境界面における回転力伝達のメカニズムの解析において、強力なツールとなると考えられる。以上の成果については、第87回日本生化学会大会（2014年10月15日～18日）において以下のタイトルで発表を行った「腸球菌Na+輸送性V-ATPaseのイオン結合部位NtpK(E139D)抑圧変異株の単離（ポスター番号2P-212）」。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は主に部位特異的変異導入により、NtpCとNtpKとの接触面に位置するアミノ酸残基について変異型酵素を作製する。腸球菌V-ATPaseのNtpCの結晶構造は未解明のため、本酵素に近縁のThermus菌H+-ATPaseサブユニットCの結晶構造を参考にする。結晶構造情報に基づき、接触面と予測されるNtpCの分子下部領域、NtpKの細胞質側ループ、およびへリックス1, 3の細胞質側について重点的に部位特異的変異導入を行う。H26年度に作製したNtpKのE50およびV138残基の変異体については、V-ATPase複合体形成および活性に対する評価を引き続き行う。単離した変異株から膜画分を調製、V-ATPase複合体を可溶化し、Native-PAGEまたはゲル濾過クロマトグラフィーにより複合体形成への影響を生化学的に調べる。V-ATPase複合体形成能を保持しているが酵素活性が低下している変異型酵素はuncouplingを起こしていると期待される。各サブユニット遺伝子を破壊したNCD株(ntpCΔ)、NKD株(ntpKΔ)を用いた相補系で各変異型酵素を発現させ、Na+依存性ATP加水分解活性とNa+輸送活性に関する反応速度論的解析を進め、イオン輸送と回転の共役に対する影響を考察する。上記と平行して、多重変異型酵素の生化学的解析を行うため、腸球菌ntpC/ntpK二重遺伝子破壊株およびNtpC変異型酵素の精製系を構築し、変異型V-ATPase複合体を精製する。Na+依存性ATP加水分解活性、NtpKリングへのNa+結合能、Na+輸送活性などについて、精製変異型酵素を用いた反応速度論的解析を行い、回転とイオン輸送のエネルギー共役に関するパラメーターを取得する。
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| Causes of Carryover |
発注予定の試薬に関して納期が3月末までに間に合わないことが判明したため、発注をH27年度へ延期した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H27年度に改めて当該試薬を発注する。
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Research Products
(1 results)
