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2015 Fiscal Year Research-status Report

線虫腸細胞内新奇オルガネラの飢餓応答性に関わる分子基盤の解明

Research Project

Project/Area Number 26860087
Research InstitutionIwate Medical University

Principal Investigator

丹治 貴博  岩手医科大学, 薬学部, 助教 (60453320)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2018-03-31
Keywords遺伝学 / 栄養シグナル / オルガネラ / 線虫 / 飢餓 / シグナル伝達
Outline of Annual Research Achievements

線虫(Caenorhabditis elegans)の腸細胞に豊富に存在するオルガネラであるHEBE顆粒は、飢餓条件下で急速に分解するが、この分解はリソソームやオートファジーに依存しない新規のメカニズムによるものと考えられる。このオルガネラ分解の分子基盤を明らかにするために、分解に必要な遺伝因子の候補を得る目的で、平成26年度からRNAiライブラリー(Open Biosystems社、約11,000クローン)を用いた網羅的なスクリーニングを行っている。線虫では、標的遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAを発現する大腸菌を餌として与えるだけで、効率的に当該遺伝子産物の発現を抑制する(feeding RNAi)ことができる。咽頭筋特異的ニコチン性アセチルコリン受容体であるEAT-2の機能に重要なEAT-18の遺伝子変異体を用いることで、feeding RNAi を効かせながら、同時にカロリー制限によりHEBE顆粒が形成・維持されなくなる条件を確立し、本年度、デジタル顕微鏡(キーエンス社)を用いたスクリーニングを完了した。この一次スクリーングで得た陽性クローンに対して、更に微分干渉顕微鏡を用いて腸内顆粒の有無をより高い精度で解析する二次スクリーニングを完了し、その結果90の陽性クローンを得た。陽性クローンの中には、RNAiにより不妊の表現型を示すものが多く、HEBE顆粒の分解と生殖腺との関連が窺われた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究開始時に、HEBE顆粒のオルガネラ分解に関わる遺伝子のRNAiライブラリーを用いたスクリーニングを、平成26年度と平成27年度の2年間で完了するという計画を立て、予定通り完遂することができた。しかし、本年度中の開始を計画していた、個々のスクリーニング陽性遺伝子の変異体・RNAi個体におけるHEBE顆粒の飢餓応答の解析を行うことができなかったため、区分を「やや遅れている」とした。解析ができなかったのは、予定していた実験補助員の雇用をしなかったためである。これは、むしろ次年度以降に集中して勤務時間を増やして雇用した方が研究の遂行に有効であると判断したためであり、結果生じた本年度までの繰越額も合わせて実験補助員への謝金に充てることで、本研究課題の計画期間中に挽回することは十分可能である。

Strategy for Future Research Activity

本年度までに行ったRNAiスクリーニングの陽性クローンについて、HEBE顆粒マーカー(GFP融合型HAF-4)発現eat-18変異線虫を用いた顕微鏡観察により、RNAiによりHEBE顆粒が維持されるか確認する。更に飢餓応答時のHEBE顆粒の分解に関与するか調べるために、HAF-4::GFP発現線虫の陽性遺伝子変異体との掛け合わせ個体もしくはRNAi個体を用いて飢餓応答を解析する。
次に、陽性遺伝子の発現細胞及び細胞内局在を解析する。自己プロモーターを含む当該遺伝子に蛍光タンパク質(GFPやmCherryなど)の遺伝子を連結した発現ベクターを遺伝子導入することで、蛍光タンパク質融合型のタンパク質を発現するトランスジェニック線虫を樹立し、その局在を共焦点顕微鏡により観察する。腸内顆粒に局在する因子に関しては、HAF-4::GFPもしくはHAF-9::mCherryとの共局在解析により、HEBE顆粒に局在するか調べる。更に、陽性遺伝子を過剰発現した時、もしくは恒常的に活性化する機能獲得(gain-of-function)型変異タンパク質を発現した時に、通常飼育条件下でHEBE顆粒の形成不全もしくは恒常的な分解が起きているか解析する。
HEBE顆粒の分解に必要な因子群について、バイオインフォマティクスから推定される機能と局在解析の結果からその相互作用を予測し遺伝学的に検証を行う。具体的には、1)二重変異体でのHEBE顆粒の飢餓応答を単一変異体と比較する、2)一方の欠損変異体と他方の過剰発現線虫・機能獲得型変異タンパク質発現線虫を掛け合わせた時にどちらの表現型を示すか調べることにより、同定した因子群のエピスタシス解析を行う。

Causes of Carryover

本研究の推進に当たっては多くの時間・人手を要することから実験補助員の雇用が不可欠であるが、地方都市のため必要な実験技術を有する者は少なく、限定された人を雇用せざるを得ない。当初、研究計画期間の4年間に渡って週2~3日雇用する予定であったが、配分額や労働者派遣法による雇用期間の上限、雇用予定者の事情等を総合的に判断し、次年度以降に集中して勤務時間を増やして雇用した方が有効であると考え、本年度までの本研究課題での雇用を見送った。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度までの繰越額も含め、予算の大半を実験補助員への謝金に充てることで研究を加速する。所属講座での線虫実験の経験者である実験補助員を4月からすでに雇用しており(週10時間)、10 月以降にもう1名雇用する予定である。謝金以外では、線虫実験に必要な培地やプラスチック消耗品、顕微鏡関連消耗品、今後支出の増加が見込まれる遺伝子工学試薬の購入や、線虫変異体の取り寄せに使用する。また、成果発表のために国内外の学会への参加費・旅費を申請する予定である。

  • Research Products

    (6 results)

All 2016 2015

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Characterization of HAF-4- and HAF-9-localizing organelles as distinct organelles in Caenorhabditis elegans intestinal cells.2016

    • Author(s)
      Tanji T, Nishikori K, Haga S, Kanno Y, Kobayashi Y, Takaya M, Gengyo-Ando K, Mitani S, Shiraishi H, Ohashi-Kobayashi A.
    • Journal Title

      BMC Cell Biology

      Volume: 17 Pages: 4

    • DOI

      10.1186/s12860-015-0076-2

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] 線虫における cdc-48 遺伝子のノックダウンは、腸細胞内の複屈折性物質の蓄積をもたらす2015

    • Author(s)
      丹治貴博、白石博久、錦織健児、田邉麻莉、田代翔平、佐藤祐紀、髙橋あかね、大橋綾子
    • Organizer
      BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会)
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド(兵庫県神戸市)
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-01
  • [Presentation] 加齢及び絶食時に線虫腸細胞内に見られるHEBE顆粒の消失と、それに伴うペプチド輸送体ホモログ(HAF-4、HAF-9)局在の変化2015

    • Author(s)
      濵田佳男、錦織健児、丹治貴博、白石博久、大橋綾子
    • Organizer
      第54回日本薬学会東北支部大会
    • Place of Presentation
      岩手医科大学(岩手県紫波郡矢巾町)
    • Year and Date
      2015-09-26 – 2015-09-26
  • [Presentation] Characterization of HEBE granules, novel organelles found in the intestine of well-fed young adult C. elegans.2015

    • Author(s)
      Takahiro Tanji, Kenji Nishikori, Syoko Haga, Yusuke Kobayashi, Yuki Kanno, Hirohisa Shiraishi, Ayako Ohashi-Kobayashi
    • Organizer
      20th International C. elegans Meeting
    • Place of Presentation
      ロサンゼルス(米国)
    • Year and Date
      2015-06-27 – 2015-06-27
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Genes involved in protein transport are required for the formation of HEBE granules, which is a novel aging and fasting-responsive organelle.2015

    • Author(s)
      Kenji Nishikori, Rei Takahashi, Mami Sato, Takahiro Tanji, Hirohisa Shiraishi, Ayako Ohashi-Kobayashi
    • Organizer
      20th International C. elegans Meeting
    • Place of Presentation
      ロサンゼルス(米国)
    • Year and Date
      2015-06-26 – 2015-06-26
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Characterization of lysosomal peptide transporters and their localizing intracellular organelles in Caenorhabditis elegans.2015

    • Author(s)
      Hirohisa Shiraishi, Takahiro Tanji, Kenji Nishikori, Ayako Ohashi-Kobayashi
    • Organizer
      BIT’s 8th PepCon Annual World Protein & Peptide Conference 2015
    • Place of Presentation
      南京(中国)
    • Year and Date
      2015-04-27 – 2015-04-27
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2017-01-06  

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