2015 Fiscal Year Research-status Report
線虫腸細胞内新奇オルガネラの飢餓応答性に関わる分子基盤の解明
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26860087
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
丹治 貴博 岩手医科大学, 薬学部, 助教 (60453320)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 遺伝学 / 栄養シグナル / オルガネラ / 線虫 / 飢餓 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
線虫（Caenorhabditis elegans）の腸細胞に豊富に存在するオルガネラであるHEBE顆粒は、飢餓条件下で急速に分解するが、この分解はリソソームやオートファジーに依存しない新規のメカニズムによるものと考えられる。このオルガネラ分解の分子基盤を明らかにするために、分解に必要な遺伝因子の候補を得る目的で、平成26年度からRNAiライブラリー（Open Biosystems社、約11,000クローン）を用いた網羅的なスクリーニングを行っている。線虫では、標的遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAを発現する大腸菌を餌として与えるだけで、効率的に当該遺伝子産物の発現を抑制する（feeding RNAi）ことができる。咽頭筋特異的ニコチン性アセチルコリン受容体であるEAT-2の機能に重要なEAT-18の遺伝子変異体を用いることで、feeding RNAi を効かせながら、同時にカロリー制限によりHEBE顆粒が形成・維持されなくなる条件を確立し、本年度、デジタル顕微鏡（キーエンス社）を用いたスクリーニングを完了した。この一次スクリーングで得た陽性クローンに対して、更に微分干渉顕微鏡を用いて腸内顆粒の有無をより高い精度で解析する二次スクリーニングを完了し、その結果90の陽性クローンを得た。陽性クローンの中には、RNAiにより不妊の表現型を示すものが多く、HEBE顆粒の分解と生殖腺との関連が窺われた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究開始時に、HEBE顆粒のオルガネラ分解に関わる遺伝子のRNAiライブラリーを用いたスクリーニングを、平成26年度と平成27年度の2年間で完了するという計画を立て、予定通り完遂することができた。しかし、本年度中の開始を計画していた、個々のスクリーニング陽性遺伝子の変異体・RNAi個体におけるHEBE顆粒の飢餓応答の解析を行うことができなかったため、区分を「やや遅れている」とした。解析ができなかったのは、予定していた実験補助員の雇用をしなかったためである。これは、むしろ次年度以降に集中して勤務時間を増やして雇用した方が研究の遂行に有効であると判断したためであり、結果生じた本年度までの繰越額も合わせて実験補助員への謝金に充てることで、本研究課題の計画期間中に挽回することは十分可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度までに行ったRNAiスクリーニングの陽性クローンについて、HEBE顆粒マーカー（GFP融合型HAF-4）発現eat-18変異線虫を用いた顕微鏡観察により、RNAiによりHEBE顆粒が維持されるか確認する。更に飢餓応答時のHEBE顆粒の分解に関与するか調べるために、HAF-4::GFP発現線虫の陽性遺伝子変異体との掛け合わせ個体もしくはRNAi個体を用いて飢餓応答を解析する。
次に、陽性遺伝子の発現細胞及び細胞内局在を解析する。自己プロモーターを含む当該遺伝子に蛍光タンパク質（GFPやmCherryなど）の遺伝子を連結した発現ベクターを遺伝子導入することで、蛍光タンパク質融合型のタンパク質を発現するトランスジェニック線虫を樹立し、その局在を共焦点顕微鏡により観察する。腸内顆粒に局在する因子に関しては、HAF-4::GFPもしくはHAF-9::mCherryとの共局在解析により、HEBE顆粒に局在するか調べる。更に、陽性遺伝子を過剰発現した時、もしくは恒常的に活性化する機能獲得（gain-of-function）型変異タンパク質を発現した時に、通常飼育条件下でHEBE顆粒の形成不全もしくは恒常的な分解が起きているか解析する。
HEBE顆粒の分解に必要な因子群について、バイオインフォマティクスから推定される機能と局在解析の結果からその相互作用を予測し遺伝学的に検証を行う。具体的には、１）二重変異体でのHEBE顆粒の飢餓応答を単一変異体と比較する、２）一方の欠損変異体と他方の過剰発現線虫・機能獲得型変異タンパク質発現線虫を掛け合わせた時にどちらの表現型を示すか調べることにより、同定した因子群のエピスタシス解析を行う。
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| Causes of Carryover |
本研究の推進に当たっては多くの時間・人手を要することから実験補助員の雇用が不可欠であるが、地方都市のため必要な実験技術を有する者は少なく、限定された人を雇用せざるを得ない。当初、研究計画期間の４年間に渡って週２～３日雇用する予定であったが、配分額や労働者派遣法による雇用期間の上限、雇用予定者の事情等を総合的に判断し、次年度以降に集中して勤務時間を増やして雇用した方が有効であると考え、本年度までの本研究課題での雇用を見送った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度までの繰越額も含め、予算の大半を実験補助員への謝金に充てることで研究を加速する。所属講座での線虫実験の経験者である実験補助員を４月からすでに雇用しており（週10時間）、10 月以降にもう１名雇用する予定である。謝金以外では、線虫実験に必要な培地やプラスチック消耗品、顕微鏡関連消耗品、今後支出の増加が見込まれる遺伝子工学試薬の購入や、線虫変異体の取り寄せに使用する。また、成果発表のために国内外の学会への参加費・旅費を申請する予定である。
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