線虫腸細胞内新奇オルガネラの飢餓応答性に関わる分子基盤の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860087
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 丹治 貴博 岩手医科大学, 薬学部, 助教 (60453320)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 遺伝学 / 栄養シグナル / オルガネラ / 線虫 / 飢餓 / シグナル伝達

Outline of Annual Research Achievements

線虫（C. elegans）の腸細胞に豊富に存在するオルガネラHEBE顆粒は、飢餓条件下で急速に分解するが、この分解はリソソームやオートファジーに依存しない新規のメカニズムによるものと考えられる。このオルガネラの形成・分解の分子基盤を明らかにするために、関連する遺伝因子の候補を得る目的でRNAiライブラリー（Open Biosystems、約11,000クローン）を用いたスクリーニングを行い、前年度までにデジタル顕微鏡、微分干渉顕微鏡を用いた二段階のスクリーニングにより、腸内顆粒（解析した最終脱皮後1日目の成虫ではHEBE顆粒が大部分を占める）の形成に影響を与えるRNAiクローン（線虫遺伝子に対応する二本鎖RNAを発現する大腸菌）を142、カロリー制限による腸内顆粒の減少を抑えるRNAiクローンを90得た。本年度は、まずこれらの陽性RNAiクローンを単離し、塩基配列をDNAシーケンシングにより確認した。更に、GFPでHEBE顆粒の膜を標識した遺伝子導入線虫（Is[haf-4::GFP]）を用いた共焦点顕微鏡観察による三次スクリーニングを進め、これまでにHEBE顆粒の正常な形成に必要な遺伝子を数十同定している。これらの中には、GFP陽性顆粒が減少・縮小するもの、GFP の蛍光が繊維状や網目状に観察されるもの、GFPの蛍光と明視野で観察される顆粒の輪郭が一致しないいびつな形態を示すものなど、これまでの明視野観察では区別できない多様な表現型があることが明らかとなった。また、飢餓による分解がオートファジーに依存しないという仮説を検証するために、オートファジー関連遺伝子変異体（atg-2(bp576)）における飢餓応答を調べた結果、HEBE 顆粒の減少は抑えられないことが明らかとなり、HEBE顆粒の飢餓による減少がオートファジー非依存であることが強く示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度の進捗状況は「やや遅れている。」であったが、当時計画した通り前年度までの繰越額も合わせて実験補助員への謝金に充てたことで、スクリーニング陽性遺伝子のRNAi個体におけるHEBE顆粒の解析（三次スクリーニング）を格段に進め、遅れを挽回することができた。

Strategy for Future Research Activity

現在進行中のHEBE顆粒マーカー（GFP融合型HAF-4）発現線虫を用いた三次RNAiスクリーニングを完了する。三次スクリーニング陽性遺伝子に関しては、飢餓応答時のHEBE顆粒の分解に関与するか調べるために、HAF-4::GFP発現線虫のスクリーニング陽性遺伝子変異体との掛け合わせ個体もしくはRNAi個体を用いて飢餓応答を解析する。
HEBE顆粒の分解に必要な因子群について、バイオインフォマティクスから推定される機能と局在、及びRNAiで見られた表現型の違いからその相互作用を予測し、遺伝学的に検証を行う。具体的には、１）二重変異体でのHEBE顆粒の飢餓応答を単一変異体と比較する、２）一方の欠損変異体と他方の過剰発現線虫・機能獲得型変異タンパク質発現線虫を掛け合わせた時にどちらの表現型を示すか調べることにより、同定した因子群のエピスタシス解析を行う。

Causes of Carryover

平成27年度からの繰越額を、28年度・29年度の２年間で実験補助員の雇用に用いる計画にしており（平成27年度実施状況報告書）、繰越額はほぼ予定通りである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度までの繰越額も含め、予算の大半を実験補助員への謝金に充てることで研究を加速する。謝金以外では、線虫実験に必要な培地やプラスチック消耗品、顕微鏡関連消耗品に使用する。

Research Products

• [Journal Article] Molecular dissection of Caenorhabditis elegans ATP-binding cassette transporter protein HAF-4 to investigate its subcellular localization and dimerization. (2017)
  • Author(s): Tanji T, Shiraishi H, Nishikori K, Aoyama R, Ohashi K, Maeda M, Ohashi-Kobayashi A.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.04.081
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 線虫腸細胞オルガネラHEBE顆粒の形成へのプロトン輸送体の関与 (2017)
  • Author(s): 井筒智成、田代和己、高橋怜衣、錦織健児、丹治貴博、白石博久、大橋綾子
  • Organizer: 日本薬学会第137年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台）
  • Year and Date: 2017-03-27 – 2017-03-27
• [Presentation] RNAi screening of genetic factors required for the biogenesis of intestinal granular organelles in C. elegans (2016)
  • Author(s): 丹治貴博、錦織健児、青山玲子、河野貴久子、細田歩、白石博久、大橋綾子
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台）
  • Year and Date: 2016-09-27 – 2016-09-27
• [Presentation] オリゴペプチド輸送体PEPT-1及びその機能に関わる腸内プロトン輸送体は線虫の加齢・栄養応答性オルガネラ（HEBE 顆粒）の形成に必要である (2016)
  • Author(s): 錦織健児、高橋怜衣、佐藤真美、丹治貴博、白石博久、大橋綾子
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 東北大学川内北キャンパス（口頭）、仙台国際センター（ポスター）（仙台）
  • Year and Date: 2016-09-27 – 2016-09-27
• [Presentation] オートファジー不全をきたすatg-2変異体における線虫腸内顆粒の飢餓応答 (2016)
  • Author(s): 中家実花、向井清人、丹治貴博、錦織健児、白石博久、大橋綾子
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-25
• [Presentation] Prominent accumulation of birefringent granules in the C. elegans intestinal cells upon RNAi of cdc-48.1 and cdc-48.2. (2016)
  • Author(s): Hirohisa Shiraishi, Kenji Nishikori, Yuki Sato, Akane Takahashi, Ryo Kikuchi, Takahiro Tanji, Ayako Ohashi-Kobayashi
  • Organizer: Aging, Metabolism, Stress, Pathogenesis, and Small RNAs in C. elegans Topic Meeting 2016
  • Place of Presentation: マディソン（米国ウィスコンシン州）
  • Year and Date: 2016-07-22 – 2016-07-22
  • Int'l Joint Research